祛風消癜合劑質量標準研究

焦紅軍，董風其，陶明暉，王皖軍，黃上林，馬超亞，唐進法

（1. 鄭州大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450014； 2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000）

臨床實踐證實，中醫藥辨證治療過敏性紫癜具有特色和優勢[1－2]。過敏性紫癜的中醫證候以風熱傷絡證(占29.5%)為主，僅次于血熱妄行證(占68.9%)，為較常見證型[3]。祛風消癜合劑源自河南中醫藥大學第一附屬醫院兒科臨床治療過敏性紫癜風熱傷絡證的多年經驗方，由忍冬藤、荊芥、防風、徐長卿、茜草、海風藤、丹參、炙甘草8 味藥材組方，具有祛風消癜、清熱止癢、化瘀通絡的功效，用于過敏性紫癜、色素性紫癜、蕁麻疹等疾病，辨證屬風熱傷絡者。經臨床應用，該方療效顯著，不良反應少，為治療過敏性紫癜風熱傷絡證的良方。為更好地促進該方院內制劑的開發和研制，推廣臨床應用，亟需對其質量標準進行研究。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中忍冬藤、防風、炙甘草進行定性鑒別，采用超高效液相色譜（UPLC）法對制劑中的原兒茶醛、馬錢苷和5 － O －甲基維斯阿米醇苷進行含量測定，以建立祛風消癜合劑的質量標準。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H－Class 型超高效液相色譜儀，包括PDA 檢測器、Empower2 色譜工作站（美國Waters公司）；XS105 型電子天平（梅特勒－托利多集團，精度為十萬分之一）；KQ －100DE 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；TLC VISUALIZER2 型薄層成像儀（瑞士卡瑪公司）。

1.2 試藥

祛風消癜合劑（河南中醫藥大學第一附屬醫院自制，批號分別為181127，181130，181201，規格為每瓶100 mL）；馬錢苷對照品（批 號為R23D7F27552），5 －O －甲基維斯阿米醇苷對照品（批號為P05M8F35478），原兒茶醛對照品（批號為P05M7F14533），均購自上海源葉生物有限公司； 甘草苷對照品（ 批號為PRF8110742，成都普瑞法科技開發有限公司)；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈和磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 薄層鑒別

忍冬藤[4－5]：取本品10 mL，水浴蒸干至2 ～3 mL，加甲醇3 mL，超聲處理（功率為100 W，頻率為40 kHz）10 min，離心5 min（3 500 r／min），取上清液，蒸干至2 mL，加硅膠粉5 g，混勻，置水浴鍋蒸干，加于裝有2 g 硅膠的G 柱（15 g，內徑為1.5 ～2.0 cm），取三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／ V／ V）10 ℃放置的下層溶液50 mL作為流動相洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加2 mL 50%甲醇溶解，作為供試品溶液；按處方制備缺忍冬藤的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液；另取馬錢苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB 中TLC 法試驗，分別吸取供試品、陰性對照品溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／ V／ V）10 ℃放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置可見光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 A。

防風[4，6]：取本品20 mL，加丙酮40 mL，混勻，過濾，濾液水浴蒸至2 mL，加入5 g 硅膠G，混勻，置水浴鍋蒸干，加于裝有2 g 硅膠G 的硅膠G 柱（15 g，內徑為1.5 ～2 cm）上，取三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）混合溶液50 mL 作為流動相洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加乙醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。按處方工藝制備缺忍冬藤的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液；取5 － O－甲基維斯阿米醇苷對照品適量，加乙醇制成每1 mL 含1 mg 的對照品溶液。照2015年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB 中TLC 法試驗，吸取上述3 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 B。炙甘草[4]：取本品10 mL，加水飽和正丁醇溶液20 mL，萃取2 次，合并正丁醇溶液，水浴蒸干，殘渣加2 mL乙醇溶解，作為供試品溶液；按處方工藝制備缺炙甘草的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液；另取甘草苷對照品，加乙醇制成每1 mL 含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照2015 年版《中國藥典（一部）》附錄ⅥB 中TLC 法試驗，分別吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15 ∶1 ∶1 ∶2，V／ V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，且陰性對照無干擾，詳見圖1 C。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1mm，1.7 μm）；流動相：乙腈(A) －0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫，0 ～3 min 時10% A，3 ～8 min 時10% ～20%A，8 ～15 min 時 20% ～25%A， 15 ～18 min 時 25% ～100%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL ／ min；檢測波長：232 nm；進樣量：1 μL。

2.2.2 溶液制備

圖1 薄層色譜圖

圖2 超高效液相色譜圖

取原兒茶醛、馬錢苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含原兒茶醛14.28 μg／mL、馬 錢 苷61.6 μg ／ mL、5 － O － 甲 基 維 斯 阿 米 醇 苷22.2 μg／mL 的混合對照品溶液。精密量取樣品2 mL，置10mL 容量瓶中，加甲醇定容，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，稱定質量，用甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得供試品溶液。按處方工藝分別制備缺丹參、缺忍冬藤和缺防風的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2 項下3 種溶液各1 μL，分別注入超高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進行測定，結果原兒茶醛、馬錢苷和5 － O－甲基維斯阿米醇苷的色譜峰與其他色譜峰分離良好，且陰性對照無干擾峰，色譜圖見圖2。

線性關系考察：分別精密吸取混合對照品溶液0.2，0.5，0.8，1.1，1.4，1.7，2.0 μL 注入超高效液相色譜儀中，測定峰面積，以進樣量（X，μg）為橫縱坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得原兒茶醛、馬錢苷和5 － O －甲基維斯阿米醇苷的回歸方程分別為Y原＝18 496 X原－8 729（r ＝0.999 9），Y馬＝5 507 X馬－9 011（r ＝0.999 9）和Y甲＝9 022 X甲－5 258（r ＝0.999 9）。結果原兒茶醛、馬錢苷和5 － O －甲基維斯阿米醇苷進樣量分別在2.86 ～28.56 μg，12.32 ～123.20 μg，4.44 ～44.40 μg 范圍內與峰面積線性關系良好（r ＝0.999 9）。

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液1 μL，依法測定，重復進樣6 次。結果原兒茶醛、馬錢苷和5 － O－甲基維斯阿米醇苷對照品峰面積的 RSD 分別為1.33%，1.69%，1.66%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12h時進樣1 μL，依法測定。結果原兒茶醛、馬錢苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD 分別為1.19%，1.19%，1.50%（n ＝7），表明供試品溶液在12h 內穩定。

重復性試驗：精密吸取同一批（批號為181127）樣品6 份，依法制備供試品溶液，平行測定。結果原兒茶醛、馬錢苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD 分別為2.96%，3.41%，2.87%（n ＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：精密吸取已知含量的樣品（批號為181127）6 份，每份1 mL，分別精密加入原兒茶醛、馬錢苷和5－ O－甲基維斯阿米醇苷對照品適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取祛風消癜合劑3 批，依法制備供試品溶液，每批樣品平行制備2 份，再按擬訂色譜條件測定含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（mg ／mL，n ＝2）

3 討論

3.1 薄層鑒別樣品制備方法優化

祛風消癜合劑方中藥味多，成分復雜。在進行忍冬藤的薄層鑒別時，參考文獻[7]，分別采用水飽和正丁醇萃取、藥液蒸干50%甲醇水溶解及乙酸乙酯萃取3 種制備方法，結果各斑點分離效果均不理想，雜質干擾嚴重，最終采用以三氯甲烷－甲醇－水（65 ∶35 ∶10，V／V／ V）10 ℃放置的下層溶液為流動相，過硅膠G 柱洗脫的制備方法去除雜質，結果色譜峰分離度較好，且陰性對照無干擾。在進行防風的薄層鑒別時[8－9]，分別采用丙酮除雜法、水飽和正丁醇萃取法和乙酸乙酯萃取法制備供試品溶液，結果以上方法均不能有效除雜，經進一步試驗，最終先采用丙酮除去部分雜質，再用三氯甲烷－甲醇（4 ∶1，V／ V）混合溶液50 mL 為流動相，過硅膠G柱洗脫進一步除雜，制備的供試品溶液薄層色譜分離度良好，且陰性對照無干擾。

3.2 供試品提取方法和色譜條件考察

考察了50%甲醇、70%甲醇、甲醇及超聲處理15，30，45 min 的提取效果[10－11]，發現甲醇超聲處理30 min最好。采用210 ～400 nm 波長范圍內紫外光譜掃描，發現最大吸收波長原兒茶醛在230 nm，馬錢苷在237 nm，5 － O －甲基維斯阿米醇苷在232 nm，綜合考慮，最終確定檢測波長為232 nm。查閱文獻[12－15]，考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.1%磷酸水溶液和乙腈－0.2%磷酸水溶液多種流動相系統，結果顯示，以乙腈－0.2%磷酸水溶液為流動相時色譜峰峰形對稱良好，樣品峰與雜質峰能達到基線分離，故選擇其為流動相。

3.3 指標成分確定

祛風消癜合劑處方中君藥忍冬藤有清熱解毒、疏風通絡功效，以及抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[16]，其主要活性成分為馬錢苷，具有增強機體免疫功能及抗炎等作用；臣藥防風具有祛風解表、勝濕止痛、止痙的功效，色原酮是其主要的活性成分，現代藥理學研究表明，5 －O －甲基維斯阿米醇苷具有良好的解熱、鎮痛、抗炎及抗血小板凝聚作用[17]；佐藥丹參具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消痛功效，其主要藥效成分是脂溶性二萜類和酚酸類成分，酚酸類具有心腦血管活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性等多種藥理活性[18]，因樣品中未檢測到丹參酮ⅡA成分，且丹酚酸B 有陰性干擾，故選擇原兒茶醛為含量檢測指標。綜合考慮，最終確定對祛風消癜合劑中的馬錢苷、5 － O －甲基維斯阿米醇苷和原兒茶醛進行含量測定。

3.4 方法評價

本試驗中建立了祛風消癜合劑的TLC 法和原兒茶醛、馬錢苷、5－ O－甲基維斯阿米醇苷的含量測定方法，該方法準確可靠、重復性好，可用于該制劑的質量控制。