高頻不可逆電穿孔的消融參數與消融有效性關系的研究

劉玉堂,韓玉,薛志孝

（天津醫科大學生物醫學工程與技術學院醫學儀器教研室，天津300070）

不可逆電穿孔（irreversible electroporation，IRE）是一種新興的治療腫瘤的非熱消融技術。其運用微秒級高壓電脈沖在細胞膜上形成納米級孔隙，導致細胞凋亡，這一過程稱為不可逆電穿孔［1-3］。最重要的是IRE 在破壞細胞膜的同時，不會引起熱焦耳加熱導致的組織損傷［4］，因此在臨床中有廣泛應用前景，尤其對于臨近重要血管和神經的病灶［5-6］。大量研究證明，IRE 在治療胰腺癌［7］、近肝靜脈或門脈的惡性肝腫瘤［8-9］、前列腺腫瘤［10］等具有較好的治療效果和可行性。然而傳統IRE 會造成局部和全身肌肉收縮，并可能影響心臟節律，造成心率失常等問題［11］。因此在臨床應用中，患者接受IRE 治療時要進行全身麻醉、肌肉麻醉以及心臟同步放電等處理［12］。高頻不可逆電穿孔（high-frequency irreversible electroporation，H-FIRE）致力于解決IRE 中存在的不足而誕生，H-FIRE 有以下幾種優點：（1）其產生頻率高達500 KHZ 以上的交替極性脈沖，減少肌肉收縮［13］。（2）可以更均勻地將細胞的跨膜電位提高到模擬電穿孔閾值［14］。（3）可以達到良好的腫瘤消融效果以及抑制腫瘤生長的目的［15］。典型H-FIRE 仍然存在局限性，研究表明，運用典型H-FIRE 進行體內3D 模型仿真消融與IRE 達到相同致死域時所需要的電場強度更高。Sano 等［16］發現H-FIRE 的不對稱輸出方式可以增大消融區域，使消融區域更加均勻。目前不同參數的H-FIRE 對于實際組織的消融范圍、有效劑量均沒有明確。

本文通過一系列動物實驗，分別對正常肝臟組織以不同場強、不同脈寬方式形式進行H-FIRE 消融，其中輸出脈寬方式包括對稱2 μs、對稱5 μs、以及不對稱3 μs 和2 μs 交替輸出的方式。結合病理分析和部分仿真結果，研究了H-FIRE 在不同場強、不同脈寬方式、不同術后天數影響下消融面積的差異性。建立了兔子肝臟腫瘤模型以及對其消融效果進行分析，評價H-FIRE 消融的有效性，為后期H-FIRE 消融腫瘤提供實驗參數依據。

1 材料和方法

1.1 實驗儀器 天津市鷹泰利安康醫療科技股份有限責任公司研發的第二代高壓陡脈沖治療儀，該儀器可以產生頻率為50～250 KHZ 的雙向高壓脈沖，輸出電壓為1000～3500V，正負脈沖均可在2～10 μs 內調節，可對組織使用高頻雙向對稱及不對稱方式進行消融；石蠟切片機：徠卡；顯微鏡：奧林巴斯；石蠟包埋機：徠卡；石蠟脫水機：徠卡；石蠟烤片機：徠卡。

1.2 材料和試劑 VX2 肝癌細胞：中國醫學科學院基礎醫學研究所；胎牛血清：gibco；DMSO：Sigma；生理鹽水：北京華興科諾生物技術有限公司；0.4%臺盼藍染液：北京索萊寶科技有限公司；超聲耦合劑：山東匯康；陸眠寧：吉林省華牧動物保健有限公司；伊紅染色液：北京索萊寶科技有限公司；蘇木素染色液：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇：天津市江天化工技術有限公司；二甲苯；天津市江天化工技術有限公司；多聚甲醛：北京索萊寶科技有限公司；PBS 緩沖液。

1.3 動物模型

1.3.1 兔正常肝臟 24 只雄性日本大耳兔（裕達，中國），平均體質量2.5 kg，常規飼養。所有動物實驗均經中國醫學科學院或生物醫學工程技術學院醫學工程研究所動物護理和使用委員會批準。

1.3.2 兔原位肝癌 腫瘤細胞制備：肝癌兔子模型首先利用凍存的VX2 細胞在兔子腋下皮膚較緊致的部位注射1 mL 細胞懸液。接種兩周后取出腫瘤組織，制成細胞懸液濃度為1×107個/mL。腫瘤細胞植入：挑選3 只雄性日本大耳兔（裕達，中國），平均體質量2.5 kg，常規飼養。按照兔子體質量肌肉注射陸眠寧0.2 mL/kg，待兔子麻醉后，將兔子取仰臥位固定在手術臺上，剃毛，在超聲探頭上抹上超聲耦合劑，找到肝臟較厚且不靠近大血管和膽管的部位，注射0.5 mL 細胞懸液。術后2 周，使用超聲觀察腫瘤模型是否建立成功，腫瘤大約長到1 cm3時，可進行H-FIRE 消融手術。

1.4 消融參數 實驗使用第二代高壓陡脈沖治療儀，正負脈寬均可調節，為方便后面分析，本研究脈寬設置有對稱方式和不對稱方式，不對稱的脈寬用P-Dp-N-Dn 表示，P 為正脈沖脈寬，Dp 為正脈沖延時，N 為負脈沖脈寬，Dn 為負脈沖延時。為了便于組間比較使用簡化的電劑量公式（1）：

其中V 是施加的電壓，Tp 是脈沖寬度，n 是施加的脈沖數。本研究通過設置不同的電壓、不同脈寬以及脈沖數來比較不同劑量下H-FIRE 消融肝臟組織的面積和效果。在相同的電壓、相同的劑量下比較脈寬為對稱2 μs、對稱5 μs 以及不對稱3-2-2-3 μs 的H-FIRE 消融肝臟組織的面積和效果。最后比較在相同劑量、相同脈寬條件下在不同時間點的H-FIRE 消融肝臟組織的變化。具體脈沖參數如表1 所示。

表1 脈沖參數設置Tab 1 Pulse parameter settings

1.5 手術消融 將24 只雄性日本大耳兔在手術前禁飼。麻醉使用肌肉注射陸眠寧和呼吸麻醉，消融時開腹并暴露肝臟，插入兩根消融電極針，分組按照上述脈沖參數完成治療并在指定天數處死動物，觀察消融部位并進行病理觀察。按照圖1 中示意脈沖波形進行消融。將3 只造模成功的腫瘤兔子按照正常兔子的消融方法，麻醉開腹并暴露肝臟，尋找造模腫瘤位置后將兩根電極針布置在腫瘤兩側（圖2），按照2000 V，不對稱3-2-2-3 μs，28000 V2s 的劑量進行消融。對照組開腹后，平行扎入電極針，但不放電。

圖1 H-FIRE 波形脈沖示意圖Fig 1 H-FIRE waveform pulse diagram

圖2 消融實驗現場操作圖Fig 2 Ablation experiment site operation diagram

1.6 大體觀察與消融面積計算 所有正常兔執行消融實驗后在不同時間點處死，取出消融肝臟組織；所有腫瘤模型兔在治療后第3 天處死，實驗組取消融肝臟腫瘤組織，對照組取腫瘤組織。通過肉眼觀察記錄消融區域顏色、形狀、大小等，隨后在視野中加入標記物和標尺，用相機拍照后導入ImageJ軟件，將標記物和標尺作為標準，換算像素與實際物體大小關系，計算消融面積。病理觀察：將取出的正常消融肝臟組織和消融肝臟腫瘤組織用PBS 清洗后放入4%多聚甲醛中，24 h 后脫水、包埋、切片，HE 染色觀察腫瘤組織形態的變化。

1.7 COMSOL 仿真模型 通過COMSOL 仿真軟件建立12 cm3的肝臟模型，添加兩根半徑為0.0695 cm，高度和間距為1 cm 的圓柱形納米針模型，通過對納米針模型電極間電壓的不同設置，模擬出場強分布，以便于對比仿真與實際結果消融區不同。電場分布由電勢梯度得到，如式（2）所示。

結合文獻中電導率的變化情況［17］，得到電導率關于電場及溫度的函數，如式（3）所示。

正常肝組織及腫瘤的初始電導率分別為0.067 S/m；α 為電導率隨溫度變化的系數；T0為組織的初始溫度，設為37 ℃；σ′為組織只在電場作用下的最大電導率，正常肝組織的最大電導率為0.241S/m［18］；f1c2hs為具有二階連續導數的平滑Heaviside 函數；E 為電場強度。

1.8 統計學分析 使用SPSS V.19.0 軟件進行統計學分析。數據表示為平均值±標準偏差。采用t 檢驗用于評估兩組之間的差異。以上所有實驗至少重復3 次。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同電壓下肝臟組織消融的大小及病理分析 本實驗觀察了H-FIRE 消融后第三天脈寬均為2 μs，電壓分別為850 V、1500 V、2000 V、2250 V 4 組的H-FIRE 消融肝臟的效果，發現電壓為850 V/cm的消融面積最小為（0.59±0.03）cm3，且消融區域不連續。隨著電壓增加，消融面積增大，1500 V/cm、2000 V/cm 和2250 V/cm 消融面積分別為（1.43±0.08）cm3、（2.25±0.33）cm3和（2.34±0.13）cm3，電壓超過2000 V/cm 后再增加，消融面積稍微增大，與2000 V/cm 組相比無明顯變化，如圖3 所示。

根據病理分析來看，電壓為850 V，電極距離1 cm 的條件下，消融區內肝細胞大量壞死，細胞膜破碎，細胞排列規則、正常，細胞間隙可以明顯看到；電壓上升到1500 V 時，肝細胞壞死加劇，細胞排列較規則，細胞間隙相對上組縮小；電壓繼續提高為2000 V 時，細胞壞死嚴重，圖中所見細胞核大量減少，細胞排列基本無規則，細胞間隙基本消失；電壓為2250 V 時，消融區內無完好細胞，細胞嚴重碎裂，細胞排列無規則，細胞間隙消失，已經不能看出肝臟細胞形態，且消融區內存在許多出血點。由此可見，單位厘米電壓的增加不僅會使宏觀上的消融區域增大，還會在微觀上影響肝臟細胞的壞死程度以及肝臟細胞間的基本排列、結構等。

圖3 2 μs 脈寬不同電壓H-FIRE 消融后第三天肝臟組織變化Fig 3 Changes in liver tissue on the third day after ablation of 2 μs pulse width and different voltage H-FIRE

觀察不同電壓條件下所形成消融區域面積大小的組間差異性，結果如圖4 所示。

圖4 2 μs 脈寬不同電壓H-FIRE 消融面積比較Fig 4 Comparison of 2 μs pulse width of different voltage H-FIRE ablation area

2.2 數學仿真與實際消融面積對比 通過COMSOL有限元仿真軟件模擬出雙針間距1 cm，兩電極之間壓差分別為850 V、1500 V、2000 V 和2250 V，不考慮脈寬方式影響時的電場分布情況，并用線條畫出大于600 V/cm［1］（步長為200 V/cm）的等勢線，計算大于600 V/cm 等勢線所包含面積。根據宏觀來看，理想的消融區形狀應該更加接近仿真形狀，以兩個針眼為中心，類似為一個扁平狀的橢圓形。然而真實的宏觀結果顯示，實際消融區與仿真結果大體形狀一致，并沒有理想中規則，其原因可能是由于肝臟組織存在密度差異，肝臟結構不規則。對比實際與數學模型之間的差異（圖5），圖中兩條曲線重合趨勢較好，可見，電場分布是決定實際消融區域形狀和大小的決定性因素。

圖5 實際消融面積與數學模型仿真面積對比Fig 5 Comparison of actual ablation area and simulation area of mathematical model

2.3 不同脈寬下肝臟消融的比較 劑量為28000 V2s，比較在消融后第三天脈寬為對稱2 μs、對稱5 μs，以及不對稱3-2-2-3 μs 3 種放電方式消融效果，發現3 種方式消融面積大小無明顯差異（P＞0.05），不對稱3-2-2-3 μs 的放電方式形成的消融區域更趨向于圓形。

對稱2 μs、對稱5 μs，以及不對稱3-2-2-3 μs 3 種放電方式消融3 d 后宏觀圖與病理圖如圖6 所示，并用紅色線條和紅色圓圈分別勾勒出消融邊緣以及入針位置。蛋白質變性在消融區內呈現出白色和黑色，脈寬為2 μs 和5 μs 時，蛋白質變性主要出現在針眼附近，呈圓圈狀，具體表現為從兩針眼開始以圓環狀向外擴展，進一步來看，2 μs 相對于5 μs蛋白質變性較規則和均勻。脈寬為不對稱3-2-2-3μs時，白色環狀變性更大，范圍更廣，且存在于兩針外圍呈橢圓形分布，蛋白質變性程度相對于脈寬為2 μs和5 μs 結果明顯更加均勻和規則。蛋白質的變性是指在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，從而導致其理化性質的改變和生物活性的喪失，其形狀體現了消融的均勻程度。由此可見，不對稱脈沖造成的消融效果相對更加均勻。從病理圖分析來看（圖6），5 μs 消融區內藍染較少，細胞核較2 μs 明顯減少，細胞損傷嚴重，細胞排列混亂。不對稱組已經看不出明顯的細胞排列結構，視野內幾乎無完好細胞，且炎性細胞較多，細胞壞死程度進一步加劇。

圖6 不同脈寬方式的H-FIRE 消融后第三天肝臟組織的變化Fig 6 Changes in liver tissue on the third day after H-FIRE ablation in different pulse width modes

2.4 H-FIRE 消融在不同時間點的變化 設置HFIRE 參數為2000V，3-2-2-3μs，劑量為28000 V2s，消融后第一天，消融部位呈暗紅色，有淤血，細胞狀態相對完整，還能觀察到完整的細胞核。消融后第三天消融部位增大，組織顏色發白，從病理觀察到細胞核碎裂，細胞縮小，細胞死亡，組織大片壞死，炎性細胞浸潤嚴重，組織消融邊界明顯。消融后第七天，明顯觀察到消融的組織面積縮小，周圍組織收縮聚集。從病理圖片上可以發現消融部位肝臟細胞完全壞死，纖維組織增生，肝細胞再生，纖維組織代替了正常組織，消融區域周圍還可以觀察到炎性細胞的浸潤（圖7）。

圖7 肝臟組織在H-FIRE 消融后不同時間點的變化情況Fig 7 Changes in liver tissue at various time points after H-FIRE ablation

2.5 腫瘤模型消融實驗結果 VX2 原位肝臟腫瘤模型均建立成功。病理圖顯示如圖8，對照組細胞核明顯大于正常的肝臟組織，核質比高，腫瘤呈巢狀生長。兩個電極針中間消融區域炎性細胞浸潤嚴重，細胞核碎裂，細胞縮小，細胞界限不清晰。消融區域周圍有明顯的消融邊界，壞死細胞與正常細胞之間能觀察到明顯的界限（圖8 中紅色線圈出），消融邊界外圍還有存活的腫瘤組織。

圖8 中，消融參數為2000 V，脈寬3-2-2-3 μs，劑量28000 V2s 進行實驗后的腫瘤模型和正常組織宏觀消融圖的消融區域邊緣及針眼位置已用紅色線標出。宏觀上來看，正常組織消融區內蛋白質變性程度更加均勻，腫瘤模型消融后腫瘤內部蛋白質變性較集中，外圍較均勻，其原因可能是消融區腫瘤呈巢狀，腫瘤組織電導率、密度、細胞致死閾值和正常組織具有很大的差別。

另外，由于腫瘤呈巢狀生長，外部存在纖維組織包膜，而H-FIRE 的原理是造成細胞膜納米級電穿孔，無法消融纖維組織，治療中也不會損傷血管。宏觀上看到的差異性很可能是殘留的纖維組織邊界造成的。微觀上來看，腫瘤模型消融區內藍染大幅減少，腫瘤細胞基本完全壞死，原本的腫瘤細胞已無細胞結構，壞死細胞無規則排列，消融區內細胞與周圍腫瘤帶形成了鮮明對比。

圖8 腫瘤消融后的宏觀圖和病理圖Fig 8 Macroscopic and pathological maps after tumor ablation

3 討論

本實驗消融過程中，觀察到實驗動物肌肉收縮減少，期間通過心電檢測發現H-FIRE 治療過程中未對心臟波形產生明顯影響。根據實驗結果和仿真結果來看，H-FIRE 脈寬為2 μs 時，單位距離間消融電壓為1500 V/cm、2000 V/cm、2250 V/cm 的實驗實際消融區域面積分別為（1.43±0.08）cm2、（2.25±0.33）cm2、（2.34±0.13)cm2。由此可見，當脈沖數超過一定范圍時［19］，影響消融區域大小的因素還是極間電壓的大小，它決定了場強的分布范圍，從而根本上影響消融的有效范圍。但隨著電壓和劑量的增大，對消融區域的影響逐漸降低。

同等劑量和單位距離間電壓相同的前提下，脈寬方式的不同會導致電導率產生不同變化［19-20］，不對稱脈寬輸出的方式可以進一步減小細胞的致死閾值［15］。然而本次實驗結果顯示，2 μs、5 μs 對稱和3-2-2-3 μs 不對稱3 種方式消融面積大小無明顯差異，值得注意的是，不對稱放電形式形成的消融區域蛋白質變性較規則和均勻，具體原因需要數值模擬結合實際情況進一步分析。消融后第一天到第七天，區域內的細胞逐漸壞死，被正常細胞代替，從這方面看，H-FIER 的消融形式主要為細胞凋亡［21］。

腫瘤消融病理分析中，消融后的腫瘤細胞細胞核碎裂，細胞界限不清，出現了明顯的細胞壞死，且消融區域邊界明顯，H-FIRE 對腫瘤細胞具有殺傷性，消融區域具有可控性。對于實際組織消融時，無論是傳統IRE 還是H-FIRE，如果想達到理想的消融區域，治療方案的參數設置尤為重要，較低的消融劑量或者較小的單位距離間電壓都可能造成無法使消融區域連續的結果，從而使消融治療不徹底，消融效果不理想。從本文的實驗與數值仿真結果來看，過高的電壓雖然會使消融區域略微增大，但效果甚微，若考慮到安全性、設備要求、耗損等條件時，單位距離間過高的電壓是沒有必要的。同理，過高的輸出劑量會增加治療時間和手術復雜程度，并且對消融區域面積大小無明顯增益，因此，過高的消融劑量同樣沒有必要；不對稱脈沖形成的消融區域蛋白質的變性更加規則和均勻，消融效果更好。結合本文實驗來看，對于兔子正常肝臟組織消融，電壓為2000 V，消融劑量為28000 V2s，放電脈沖為3-2-2-3 μs 不對稱形式得到的消融效果最為理想。

本次實驗中，從宏觀和病理圖來看，未發現消融區內存在肝臟血管損傷，與Siddiqui 等［3］所得結論一致；另外，本次實驗中觀察到實驗兔均無明顯顫抖出現，肌肉收縮現象不明顯，結果與Sano、Arena等［13］發現高頻雙向脈沖抑制肌肉收縮的結論一致；從病理分析來看，H-FIER 的消融形式主要為細胞凋亡［21］。實驗中發現，高頻雙向不對稱脈沖與對稱脈沖所造成消融區域并沒有明顯差別，與Sano 等［16］數值模擬得到的非對稱H-FIRE 波形能夠產生比對稱H-FIRE 波形更大消融區域的結論不一致，具體造成實際結果與仿真模擬結果不同的原因還需進一步研究。值得注意的是，本實驗中發現不對稱脈沖所得到的消融區域形狀更趨于圓型，蛋白質變性更加均勻和規則，造成此現象的原因還需要更多的模擬數據和實驗數據來進行進一步的探索討論。不對稱H-FIRE 對于腫瘤細胞的殺傷性，消融區域的可控性在本次實驗中得到驗證，與H-FIRE 可以成功破壞腫瘤細胞的結論一致［22］。

本文通過實驗，結合部分仿真結果，研究了HFIRE 在不同劑量、不同脈寬方式、不同術后天數影響下消融面積的差異性，展示了在H-FIRE 消融時電壓、劑量、脈寬方式的不同時對消融區面積的大小，消融區域內蛋白質變性形狀和程度造成的不同影響，并通過建立和消融兔子肝臟腫瘤模型，評價了H-FIRE消融的有效性，驗證了已有結論，發現了未探索的問題，為H-FIRE 在今后的研究提供了數據支持。