考馬斯亮藍G250法測定蛋白質含量的教學實踐及方法學探討

祝連彩 唐士金 周麗

[摘 要] 該文研究之目的：考馬斯亮藍G250法測定蛋白質含量是生物化學實驗教學的基本實驗之一。為了更好地開展實驗教學，對實際教學中發現的該方法組間穩定性及線性相關性存在的問題進行研究和探討。之方法：在對問題出現原因進行解析的基礎上，對影響實驗穩定性的因素和線性范圍進行了實驗研究。之結果：發現該方法的顯色穩定時間為60min，線性范圍為1.0-30.0μg/mL。之結論：將研究成果引入實驗教學，將有利于學生對于實驗原理的理解，并消除學生對組間實驗結果差異大的疑慮，提高實驗教學效果。

[關鍵詞] 蛋白質含量;考馬斯亮藍G250;顯色穩定性;Lambert—Beer定律;線性范圍

[作者簡介] 祝連彩（1975—），女，山東費縣人，工學博士，重慶大學生物工程學院、現代實驗教學中心高級實驗師，主要從事生物化學實

驗、生物制藥工程領域教學與研究。

[中圖分類號] G642? ? [文獻標識碼] A? ? [文章編號] 1674-9324（2020）23-0266-04? ? [收稿日期] 2019-10-16

蛋白質是生命的物質基礎，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。蛋白質含量測定法，是生物科學研究中最常用、最基本的分析方法之一，也是“生物化學實驗”的重要教學內容之一。目前，常用蛋白質含量測定方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍法（Bradford法）[1-3]。其中考馬斯亮藍法是由Bradford于1977年根據蛋白質與染料相結合的原理設計的[4]。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法，因而得到了廣泛的應用[5-7]?？捡R斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中通過氫鍵和范德華力與蛋白質結合，染料蛋白質復合物的最大吸收峰的波長由染料的465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為亮蘭色[4]。在595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。

一、學生實驗結果的數據分析

（一）標準曲線制作方法

1.0～100微克/毫升標準曲線的制作。

取6支試管，按表1數據配制0～100微克/毫升牛血清白蛋溶液各1毫升：

準確吸取所配各管溶液0.1毫升，分別放入10毫升具塞試管中，加入5毫升考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞，將試管中溶液縱向倒轉混合，放置2分鐘后用10毫米光徑的比色杯在595nm下比色。繪制標準曲線。

2.0～1000微克/毫升標準曲線的制作。

另取6支試管，按表2數據配制0～1000微克/毫升牛血清白蛋白溶液各1毫升，按前述方法進行實驗，繪制標準曲線。

（二）實驗結果

共有10組同學開展實驗，5個組進行0～100微克/毫升標準曲線的制作，另5個組進行0～1000微克/毫升標準曲線的制作。進行0～100微克/毫升標準曲線的制作的有2組同學出現操作失誤，進行0～1000微克/毫升標準曲線的制作的有1組出現操作失誤。我們對不存在操作失誤的同學的數據進行了分析，結果見表3和表4。

從表3、表4的RSD項看，實驗的標準偏差在13.6%～27.3%，在相同試劑和相同儀器條件下，組間的實驗結果相差大，組間穩定性不好。從表3我們可以看到在反應體系蛋白質濃度0.39～1.96μg/mL范圍內，溶液的吸光度值較小，除1個以外都在0.100以下，且在該濃度范圍內，吸光度和蛋白質濃度的線性相關性低，第2組同學的線性相關系數最大，也僅是0.9711。表4的相關系數結果表明在反應體系蛋白質濃度3.92～19.61μg/mL范圍內，吸光度和蛋白質濃度具有較好的線性相關性。

（三）存在問題

通過對操作過程和實驗結果分析，我們認為造成組間實驗結果差異大，線性相關性低的原因可能有：

1.顯色時間不一樣。同學們需要在規定的課堂時間完成實驗，所以基本上是同時開始實驗的。但由于實驗室只有1臺分光光度計，顯色完成后測定的時間就無法控制一致。因此考馬斯亮藍G250與蛋白質的顯色反應的時間穩定性可能是造成組間差異的重要因素。

2.操作方法。在兩個濃度范圍的標準曲線制作方法中，均是先配制系列蛋白質濃度的1mL的蛋白質溶液，再取0.1mL加入反應體系。由于0.1mL的量太少，而在本科實驗教學中又不可能使用進口的高精度的移液器，易于造成誤差。特別是在0～100微克/毫升牛血清白蛋溶液的配制中，移液量為20μL～100μL，更易造成組間差異。

3.線性范圍。分光光度法被用來測定溶液中存在的光吸收物質的濃度，其理論依據是Lambert和Beer定律。而Lambert—Beer定律具有一定的適用范圍，一般情況下，吸光值在0.2-0.8時，濃度與吸光度才具有良好的線性范圍[ 10 ]。在吸光度小于0.2和大于0.8的情況下，線性是否良好，需要進行試驗研究和探討。

二、方法學探討

針對上述問題，我們對考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量的線性范圍、顯色穩定性、染料用量進行了研究。

（一）主要儀器和試劑

T6型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司，標準蛋白質溶液：稱取牛血清白蛋白（Sigma公司），用蒸餾水配制成250μg/ml、250μg/ml和10μg/ml標準蛋白質溶液。考馬斯亮藍G-250試劑：考馬斯亮藍G-250（進口分裝，上海進出口試劑公司）100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。

（二）試驗方法

1.顯色穩定性。取50.0微克/毫升牛血清白蛋白標準溶液1.0mL加入10毫升具塞試管中，在加入4.0mL考馬斯亮藍溶液，將試管中溶液縱向倒轉混合，分別放置10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、120min后，在595nm下測定吸光度。每個時間點做3個平行，取平均值。

2.考馬斯亮藍G-250染色液的用量。在反應體系蛋白質濃度為10μg/mL的條件下，按表5考察染料用量對吸光值的影響。每管做3個平行，取平均值。

3.線性范圍。按表6進行試驗，考察蛋白質濃度0.2μg/mL～50.0μg/mL范圍的線性。每管做3個平行，取平均值。

（三）數據處理

數據以平均值±標準偏差（x±SD）表示，應用SPSS 16.0 for Windows進行統計學分析。兩組間比較采用t檢驗，P<0.05被認為具有統計學差異。

（四）試驗結果與討論

1.顯色穩定性。從圖1可知，在蛋白質濃度為10μg/ml時，顯色時間在20min時，吸光度達到最大，為0.423。20min后，隨顯色時間的延長，吸光度降低，60min時降至0.361，與20min時的吸光度相比差異顯著（P≤0.05）。顯色60min后，吸光度趨于穩定，90min和120min的吸光度值與60min的相比無顯著差異性。表明蛋白質與考馬斯亮藍G250的顯色反應要達到60min后才能達到穩定。以往的生物化學實驗教材中指出該顯色反應在2min達到穩定，這導致很多方法學探討的文獻忽略了顯色時間的研究。我們在以往的教學中也忽略了對學生實驗顯色時間的嚴格控制，這可能是造成在學生實驗數據偏差大的主要原因。在學生實驗中由于實驗條件的限制（儀器的數量），可以要求學生控制標準曲線制作和樣品測定的顯色時間保持一致來確保含量測定的準確性。但在科學研究中，最好將顯色時間控制在60min，顯色穩定后再進行測定。

2.考馬斯亮藍G-250染色液用量的影響。在不同的實驗指導教材中，染料的用量也存在不同。有些是0.1mL樣品液加5mL染料;有些是1.0mL樣品液加4mL或5mL染料[2，11，12]。為使實驗結果穩定，利于實驗教學，我們對染料用量進行了考察。

由圖2可知，在顯色體系蛋白質濃度一定的情況下，考馬斯亮藍G250用量為4.0mL、4.5mL和4.8mL時的吸光度顯著高于3.0mL時的吸光度，p<0.05;而考馬斯亮藍G250用量為4.0mL、4.5mL和4.8mL時，三者間無顯著差異，p>0.05。這表明染料用量過少會影響體系的吸光度，需達到4.0mL以上。染料用量過少會影響實驗的穩定性，用量過多在大規模的教學實驗中又會增加成本和和廢液的處理量，因此實驗中選擇4mL的染料比較合適。

3.線性范圍。為考察吸光度與顯色體系蛋白質濃度間的線性關系，我們在0.2～50μg/mL范圍內設置了13個濃度，顯色后測定吸光度值，將數據進行線性回歸，回歸方程和標準曲線見圖3.由圖3可知，在0.2～50.0μg/mL、5.0～50.0μg/mL和0.1～1.0μg/mL的濃度范圍內，蛋白質濃度和吸光度不具有良好線性關系，相關系數均小于0.99;在1.0～30.0μg/mL范圍內，蛋白質濃度和吸光度具有良好線性關系，相關系數大于0.999。表明，蛋白質濃度大于30.0μg/mL或小于1.0μg/mL，蛋白質與考馬斯亮藍G250的顯色反應都不再遵循Lambert-Beer定律，即考馬斯亮藍G250法測定蛋白質含量的線性范圍為1.0～30.0μg/mL。文獻中關于該方法線性范圍有著很大的差別，有0～1000g/mL的，也有10～100μg/mL的[1，13]，這些表述都是基于蛋白質標準樣品的濃度，而非顯色反應體系中蛋白質的實際濃度。我們的實驗指導也采用了相同表述，比如在1.1和1.2中0～100μg/mL標準曲線的制作。線性范圍應以顯色反應體系的蛋白質濃度范圍表示較為規范，利于學生對實驗原理，特別是Lambert-Beer定律的理解。

三、結語

在實驗教學過程中發現了學生實驗組間穩定性差和低濃度標準曲線線性相關系數低的問題。在對問題出現原因進行解析的基礎上，對影響實驗穩定性的因素和線性范圍進行了研究，確定了顯色劑用量、顯色穩定時間和該方法的線性范圍。

參考文獻

[1]張蕾，劉昱，蔣達和，等.生物化學實驗指導[M].武漢：武漢大學出版社，2011，99-101.

[2]裴秀英.生物化學實驗教學指導[M].西安：第四軍醫大學出版社，2009，24-25.

[3]李寧.幾種蛋白質測定方法的比較[J].山西農業大學學報，2006，26（2）：132-134.

[4]Sedmak JJ，Grossberg SE.A rapid，sensitive，and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G250[J].Anal Biochem，1977，79（1-2）：544-552.

[5]馮昕，王吉中，堯俊英，等.考馬斯亮藍法測定乳與乳制品中蛋白質含量[J].糧食與食品工業，2010，17（3）：57-59.

[6]羅群.考馬斯亮藍法快速測定菜籽粕中可溶性蛋白質的含量[J].成都大學學報自然科學版（自然科學版），2014，33（2）：125-127.

[7]王艾平，周麗明.考馬斯亮藍法測定茶籽多糖中蛋白質含量條件的優化[J].河南農業科學，2014，43（3）：150-153.

Teaching Practice and Methodological Investigation of Protein Content Determination Using Coomassie Brilliant Blue G250

ZHU Lian-cai，TANG Shi-jin，ZHOU Li

（Modern Experiment Teaching Center，Bioengineering College，Chongqing University，Chongqing 400030，China）

Abstract：The Coomassie Brilliant Blue Method is widely used for the determination of protein and is also one of the basic experiments of biochemistry experiment teaching.In order to carry out the experimental teaching effectively，we studied the factors affecting the stability of the experiment and the linear range.The results show that the chromogenic reaction reaches to stability after 60 min and the linear range of this method is 1.0-30.0μg/mL.The results of the study will be beneficial to understanding the experimental principle，eliminating the bewilderment of students on the large difference among difference groups，and improving the effect of experiment teaching.

Key words：protein content;Coomassie Brilliant Blue G250;chromogenic stability;Lambert Beer's law;linear range