乳酸菌生物膜的篩選及對銅的吸附能力分析

張凱迪，蔣家璇，姚沛琳

（宿州學院生物與食品工程學院，安徽宿州 234000）

乳酸菌是食品發酵工業的常用菌種，賦予食品特殊的口感及風味，受到廣大消費者的歡迎[1]。目前對乳酸菌的研究，已經不局限于發酵食品的加工，研究者越來越關注對人體健康起到的關鍵作用。近年來，有研究者發現乳酸菌具有吸附重金屬的功能，可以有效吸附食物中的重金屬[2]。

生物膜是由細菌細胞、胞外聚合物和其他顆粒物的水合混合物所組成[3]。生物膜可處理有機污染物和一些無機離子，這影響著水環境中重金屬的遷移、轉化、生物可利用性及最終歸屬[4]。由于生物吸附法具有去除效率高、處理成本低、重金屬易于洗脫回收，尤其適用于處理低濃度重金屬廢水等優點，受到國內外學者的廣泛關注[5]。

細菌生物膜中的細菌，與浮游狀態的細菌相比，對抗生素和宿主免疫防御系統具有較強的抗逆性[6]，因此可以使乳酸菌產生生物膜來抵抗外界的環境變化；另一方面，還可以利用生物膜凈化水質和抑制某些食品腐敗菌的生長。因此，深入分析生物膜狀態下的乳酸菌對重金屬的吸附作用，可以為乳酸菌吸附重金屬研究一種新的思路。

以分離于自然發酵食品的乳酸菌為研究對象，篩選具有生物膜形成能力的乳酸菌，模擬水體生物膜凈化水質的原理，研究生物膜狀態下的乳酸菌對銅離子的吸附能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、葡萄糖、吐溫80、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸氫二胺、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、結晶紫等，國藥集團提供；銅離子標準液，中國計量科學院標準物質中心提供。

乳酸菌從自釀發酵食品中分離得到，如腌制菜、酸奶、葡萄酒等。

1.2 儀器與設備

SHP-400FE型生化培養箱、722G型可見分光光度計、火焰原子分光光度計（普析）、熒光顯微鏡、96孔平底培養板、酶標儀，美國Thermo公司產品；SIGmR型小型臺式離心機。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取樣品液1 mL，按梯度稀釋法準備10-1，10-2，10-3，10-4，10-5稀釋液，然后依次取50 μL稀釋度為10-3，10-4，10-5的樣品，涂布于MRS固體平板上，倒置于37℃恒溫箱內培養48 h。采用平板劃線法，挑取典型菌落，多次劃線后得到純菌株。經菌落形態觀察、革蘭氏染色鏡檢、接觸酶試驗，將革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗陰性的菌株接種到MRS液體培養基中，過夜培養，于-80℃下甘油保藏[7]。

1.3.2 96孔板法篩選可產生生物膜的乳酸菌

把分離純化得到的48株乳酸菌活化培養后，調節菌濃度，制成OD600nm為0.1的菌懸液，取菌懸液300 μL加入96孔板中，培養48 h。培養完成后棄去原培養基，以PBS緩沖溶液洗滌除去浮游狀態的菌（重復進行3～4次），使用甲醇固定培養15 min，棄去孔內液體，冷風吹干。取100 μL 1%結晶紫溶液依次加入每個孔，染色15 min后用去離子水去除孔壁染液（重復進行4～5次），冷風吹干。每孔中依次加入200 μL 95%乙醇，同時微量振蕩30 min，最后采用酶標儀測定OD600nm處的OD值，做6次平行試驗[8]。

1.3.3 乳酸菌游離狀態對銅離子吸附的研究

（1）銅離子儲備液的配制。準確稱取無水硫酸銅（分析純）9.856 g，溶于一定體積的去離子水中，定容至1 L，并使用0.2 μm無菌濾膜過濾除菌，即得2.5 g/L無菌CuSO4儲備液[9]。菌體活化與菌懸液的配制：將菌株液體培養至3代后，取對數中后期的菌液于4℃條件下，以轉速8 000 r/min離心5 min，收集菌體，以無菌生理鹽水洗滌菌體沉淀，重懸后離心，重復3次，最后離心并重懸菌體，制成10 g/L的菌懸液[10]。

（2）乳酸菌降銅離子試驗。按上述方法制備各乳酸菌的菌懸液，備用。用去離子水稀釋CuSO4儲備液，向溶液中加入乳酸菌菌懸液，此時加入濃度為0.1 mol/L NaOH溶液調節pH值時會使銅離子沉淀，故不調節pH值，使菌體終質量濃度為1 g/L，Cu2+終質量濃度至50 mg/L。將反應體系放在37℃恒溫搖床以轉速120 r/min培養48 h，離心保留上清液。參照國標測定其中的銅離子質量濃度。每組3次重復，空白對照設置為未加入菌體的50 mg/L CuSO4溶液[11]。其中，菌體對Cu2+的去除率公式為：

式中：C0——起始Cu2+質量濃度，mg/L；

C1——體系剩余的Cu2+質量濃度，mg/L。

1.3.4 乳酸菌成膜狀態下對銅離子吸附研究

將乳酸菌活化培養，培養至3代時，調節OD值，制成OD=0.1的菌懸液，移取1 mL，加入48孔板中進行培養，37℃條件下培養24 h。使用PBS緩沖液洗滌2～3次，之后加入1.35 mL銅離子儲備液，在恒溫搖床中培養48 h，測定培養液中的銅離子含量[12]。

2 結果與分析

2.1 篩選具有成膜能力乳酸菌的結果

乳酸菌的成膜能力見表1。

表1 乳酸菌的成膜能力

由表1可知，48株乳酸菌中有16株乳酸菌，在成膜能力試驗中，96孔板法測得的吸光度大于1.0，說明能夠形成生物膜。其中，菌株Q-3，Q-2，G-3，Q-1，SY1-3吸光度較高，分別為 3.04，2.948，2.852，2.672，2.021，表明其成膜能力較強；菌株Q-4，6-3，2-2，6-2，5-3 的吸光度在 1.5～2.0 之間，成膜能力一般；菌株F-3，7-2，G-2，7-1，13-1，2-1的吸光度在1.0～1.5，成膜能力較小。

2.2 游離狀態下的乳酸菌對銅離子吸附結果

游離狀態下的乳酸菌對銅的吸附能力見表2。

表2 游離狀態下的乳酸菌對銅的吸附能力

由表2可知，48株乳酸菌對銅離子均具有一定的吸附能力，且不同菌株對銅的吸附能力顯示出較大的差異，而且只有少數乳酸菌對銅離子的吸附能力較高，如菌株6-2，SY2-1，SY1-1吸附率分別為35.2%，33.3%，31.1%。

2.3 生物膜狀態下的乳酸菌對銅離子吸附結果

根據2.2和2.3的試驗結果可知，菌株SY1-3成膜能力高，且吸附銅離子能力較高；菌株Q-3成膜能力高，但吸附銅離子能力一般；菌株5-3成膜能力一般，且吸附銅離子能力低；菌株6-2，6-3成膜能力一般，但吸附銅離子能力高。因此，選擇菌株SY1-3，Q-3，5-3，6-2，6-3這5株菌為研究對象，研究它們在生物膜狀態下對銅離子的吸附能力。

生物膜狀態下的乳酸菌對銅的吸附能力見表3。

由表3可知，這5株菌在生物膜狀態下對銅離子均具有一定的吸附能力，但是不同菌株對銅離子的吸附能力差異不大，而且除了菌株5-3外，其他4株菌在生物膜狀態下對銅的吸附能力均低于游離狀態。結果表明，游離狀態下的乳酸菌對銅離子的吸附能力較生物膜狀態下強，而且對銅離子的吸附能力與其是否處在生物膜狀態下無關。

表3 生物膜狀態下的乳酸菌對銅的吸附能力