IGF-1 受體和雌激素受體在胚胎移植失敗患者子宮內膜中的表達及其與子宮內膜容受性的關系

劉艷君 卜曉萌 張巧利 褚春芳 馬延敏 王 雪

子宮內膜容受性降低是臨床胚胎移植反復失敗的主要原因之一[1]。胞突飲是子宮內膜容受性的輔助評估指標之一，然而目前還不能準確檢測胞突飲發育情況，因此尋找可靠的生物標志物來評估子宮內膜容受性，可能對降低胚胎移植失敗率有重要意義[2-3]。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors，IGF-1)及其受體(IGF-1R)分布于人體各組織，對胚胎早期種植及滋養層細胞的侵入和遷移有促進作用[4]。雌激素(estrogen，E)是一類含18個碳原子的類固醇激素，對乳腺細胞分化、乳腺導管上皮增生及泌乳均有重要作用[5]。目前國內外對IGF-1R、雌激素受體(estrogenreceptor，ER)與妊娠高血壓、糖尿病及妊娠期子宮肌瘤之間關系的研究較多[6-7]，然而IGF-1R、ER在反復胚胎移植失敗患者子宮內膜中的表達及其與子宮內膜容受性關系的研究仍較少。本研究通過檢測反復胚胎移植失敗患者及首次冷凍胚胎移植獲得臨床妊娠的患者子宮內膜中IGF-1R、ER mRNA水平及其與子宮內膜容受性的關系，以期為探索子宮內膜容受性預測指標開辟新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年9月至2018年7月首都醫科大學附屬北京婦產醫院生殖中心就診的胚胎移植3次均失敗的86例患者為研究對象(觀察組)；同時期選取首次冷凍胚胎移植獲得臨床妊娠的73例患者作為對照組。兩組年齡、體質指數(body mass index，BMI)、不孕年限等資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。納入標準：①3次及以上胚胎移植均失敗者[胚胎移植15 d測血人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)≥50 IU/L為生化妊娠，否則均視為胚胎移植均失敗]；②資料齊全者；③B超顯示子宮形態正常者；④基礎內分泌正常、月經規律者；⑤卵泡晚期內膜三線征明顯，厚度≥8 mm者。排除標準：①3個月內宮腔操作及激素治療者；②子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征者；③伴高血壓、先天性心臟病等心血管疾病者；④伴有糖尿病等內分泌疾病者。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法 查閱門診病歷，收集患者入院前一般資料，包括年齡、BMI、不孕年限、不孕原因、不孕類型等，所有患者均由2名及以上主治醫師明確診斷。采用qRT-PCR法檢測患者子宮內膜中IGF-1R、ER mRNA表達水平；通過掃描電鏡檢測子宮內膜胞飲突發育情況；采用Pearson法分析患者子宮內膜IGF-1R、ER水平與發育完全胞飲突數量的相關性。

1.2.1 子宮內膜標本采集及保存 所有研究對象均于種植窗期(排卵第6～8天)取少許子宮內膜標本，若經B超檢測卵泡發育情況發現不排卵，則放棄本周期檢查。采用直徑0.3 cm的子宮內膜取樣器采集中段標本，立即用生理鹽水洗去血污，干紗布吸去水分，迅速置于-20℃保存待測。

1.2.2 控制性超促排卵及胚胎移植方案 所有研究對象均于體外受精/卵泡漿內單精子注射受精-胚胎移植。于控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)周期的月經第1～3天起每日肌注促性腺激素(gonadotropin，Gn)(齊一生物科技；批號：4778-1000，1 mg)并進行B超檢測卵泡發育。當有2～3個卵泡直徑大于18 mm時，停用Gn，肌肉注射hCG(上海雅吉，批號：41115P，100 μL)10 000 IU，36 h后取卵并受精。在取卵后第3～6天選擇優質胚胎進行冷凍玻璃化保存。采用自然周期法準備子宮內膜，參考之前月經周期規律，于月經結束第8～12天進行陰超檢查，監測卵泡發育及子宮內膜生長情況。在優勢卵泡直徑≥14 mm時檢測尿促黃體生成素(lutein hormone，LH)；在卵泡直徑≥18 mm時，檢查患者LH、雌激素(Estradiol，E2)和孕酮(Progesterone，P)。采用快速復溫法復蘇胚胎，孵育2 h后選擇2枚優勢胚胎進行移植。

1.2.3 qRT-PCR法檢測子宮內膜IGF-1R、ER mRNA水平 采用上海名勁生物科技有限公司生產的Trizol RNA提取試劑盒(貨號：5003050)提取子宮內膜總RNA，反轉錄得cDNA，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。采用廣州市百菱生物科技有限公司生產的ABI 7500實時熒光定量PCR儀對IGF-1R、ER進行擴增。qRT-PCR反應體系共10 μL：cDNA(50 ng/μL)1μL，德國QIAGEN公司生產的miScript SYBR?Green Mix(貨號：218076)5 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，雙蒸水 3.0 μL，引物由上海生工生物公司合成。反應條件：95℃，5 min；95℃、15 s，58℃、1 min，40個循環；72℃，10 min。IGF-1R、ER及內參GAPDH的引物序列見表2。每份樣品均設3個重復孔，采用2-ΔΔCT法對子宮內膜IGF-1R、ER mRNA含量進行定量分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.4 子宮內膜胞飲突發育檢測 采用掃描電鏡觀察子宮內膜胞飲突發育狀況，記錄3個內膜面的胞飲突數目的平均值，發育程度判斷標準與Mirkin等[8]報道標準一致(若在同一子宮內膜樣本中觀察到不同發育階段的胞飲突，僅記錄其最普遍存在的表達方式)。膜狀突起開始形成，并發展到整個細胞頂部，微絨毛變短、變少、相互融合，即為發育中的胞飲突；微絨毛完全消失、膜狀突起變大，高于纖毛細胞，形狀如蘑菇，即為完全發育的胞飲突；胞飲突開始萎縮，微絨毛重新出現，細胞體積變大，即為退化中的胞飲突。

1.3 觀察指標 ①比較兩組控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)及移植情況；②比較兩組子宮內膜IGF-1R、ER mRNA水平；③比較兩組子宮內膜胞飲突發育情況；④分析IGF-1R、ER與發育完全胞飲突數量的相關性。

2 結果

2.1 兩組COH及移植情況比較 兩組Gn用量、Gn使用天數、基礎卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)、獲卵數、移植日內膜厚度、移植胚胎數目、移植優質胚胎數目、受精率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組COH及移植情況比較

2.2 兩組子宮內膜IGF-1R、ER mRNA水平比較 觀察組子宮內膜IGF-1R、ER mRNA水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩組子宮內膜IGF-1R、ER mRNA水平比較

2.3 兩組子宮內膜胞飲突發育情況比較 對照組子宮內膜胞飲突發育完全例數較多，觀察組胞飲突發育中/退化例數較多，兩組差異有統計學意義(P<0.05)。觀察組子宮內膜胞飲突完全發育數目低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5。

2.4 IGF-1R、ER與發育完全胞飲突數量的相關性 IGF-1R、ER水平與完全發育胞飲突數量均呈正相關(r=0.699、0.650，P均<0.05)。見圖1、2。

表5 兩組子宮內膜胞飲突發育情況比較

圖1 IGF-1R與發育完全胞飲突數量的相關性

圖2 ER與發育完全胞飲突數量的相關性

3 討論

隨著輔助生殖技術發展及胚胎移植技術日益成熟，不孕患者妊娠率大幅提高，但仍有許多患者胚胎移植反復失敗，其主要原因是子宮內膜容受性較差促使胚胎著床成功率降低[9-10]。目前用于預測子宮內膜容受性的標志物及方法主要有胞飲突、蛋白組學、子宮內膜容受性芯片，為探索生化標志物用于預測子宮內膜容受性提供了有利條件[11]。本研究探究子宮內膜IGF-1R、ER水平與其容受性的關系，為IGF-1R、ER作為預測子宮內膜容受性的生化標志物提供了基礎。

IGF-1與其受體IGF-1R特異性結合后能激活胰島素受體底物蛋白通路，促進細胞遷移和增生。IGF-1R能作用于卵母細胞，促進卵母細胞的成熟。IGF-1R水平影響子宮內膜的增殖和發育，可能進一步影響子宮內膜容受性和胚胎著床的成功與否[12-13]。ER在子宮內膜的間質及腺體廣泛分布且呈周期性表達，除調節雌激素水平外還能控制子宮內膜的生長，控制子宮內膜對激素的應答[14]。ER可通過解除對某些基因的抑制，在種植窗期起到降調解作用，從而在子宮內膜容受性的形成中發揮重要作用[15]。

本研究結果顯示，觀察組子宮內膜中IGF-1R、ER水平低于對照組，且與發育完全胞飲突的數量均呈正相關，與王巧鳳等[16]研究結果相似。提示胚胎移植失敗患者子宮內膜中IGF-1R、ER水平均低于首次胚胎移植妊娠成功人群，推測可能原因是IGF-1R、ER通過降低表達水平，調節雌激素的水平，抑制卵母細胞的成熟及子宮內膜的發育，影響子宮內膜的容受性，進一步降低胚胎著床的成功率，使得妊娠失敗。兩者水平與胞飲突呈明顯相關性進一步提示，IGF-1R、ER水平與子宮內膜容受性有密切聯系。胡秋蘭等[17]在研究針灸改善子宮內膜容受性的進展中表明，可通過針灸提高ER水平，從而改善胚胎移植反復失敗患者子宮內膜的容受性，提示ER與子宮內膜容受性有密切聯系，與本研究結論基本一致。本研究中，兩組年齡、BMI、不孕年限、不孕類型、助孕方式、Gn用量、Gn使用天數、基礎FSH、獲卵數、移植日內膜厚度、移植胚胎數目、移植優質胚胎數目、受精率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，提示基礎因素對妊娠成功與否影響較小。

綜上所述，IGF-1R、ER水平能作為預測子宮內膜容受性的參考指標，臨床可通過密切監測其水平，采取合理措施改善妊娠結局。但本研究受樣本量、地域、實驗條件等因素影響，目前只能將兩者水平作為參考指標，不能進行臨床應用，需加大樣本量對其臨床應用價值及具體作用機制進一步深入研究。