黃芪甲苷介導TLR4-p38 MAPK信號通路在幼鼠急性肺損傷中的研究

王 茜萬 靜譚揚茗羅丹丹熊海英姜 紅

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院兒科,武漢 430014)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是兒科各個年齡組最常見的潛在的危害性最大的疾病之一,急性肺損傷的發生和發展涉及到多種病理生理過程,目前研究發現ALI的發病機制主要由炎癥反應/抗炎反應的失衡造成,其發病率及病死率極高[1]。內毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是引起ALI的重要因素之一,研究表明,LPS可刺激缺氧誘導因子1-α(hypoxia inducible factoR-1α,HIF-1α)的聚集[2],通過增加其轉錄與蛋白翻譯,抑制蛋白降解[3],HIF-1α可進一步激活其靶基因血管內皮生長因子,共同參與炎癥性肺損傷的病理過程[4]。Toll受體4(toll-like receptor 4,TLR4)作為Toll家族的一員,已被確認為LPS的模式識別受體[5]。研究表明,TLR4可通過髓系分化因子88(MyD88)激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)信號通路,誘導炎癥發生[6]。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分之一,具有抗炎、抗氧化、改善心肌缺血、抗病毒等作用[7-12]。另外,黃芪在治療急性肺損傷方面也發揮重要作用[13-15]。本研究以SD大鼠為研究對象,利用LPS誘導幼鼠急性肺損傷模型,以地塞米松為陽性藥做對照,觀察黃芪甲苷對急性肺損傷模型(幼鼠)TLR4-p38 MAPKs信號通路的影響,以期闡明黃芪甲苷在幼鼠急性肺損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8周齡SPF(specific pathogen free)級健康SD雌性孕鼠6只,體重200～220 g,購自湖北省疾控中心[SCXK(鄂)2015-0018]。于武漢華聯科生物技術有限公司動物模型研究院SPF條件下飼養[SYXK(鄂)2018-0104]。飼養環境為溫度22℃～26℃,相對濕度50%～60%,人工光照明暗各12 h,給予標準飼料和純凈水喂養。新生仔鼠母乳喂養至第7天隨機分為4組,每組6只。本實驗經武漢華聯科有限公司模型動物研究院倫理審查委員會審查批準(HLK-20190303-01)。實驗過程中對實驗鼠的處置符合中華人民共和國科學技術委員會頒布的《實驗動物管理條例》的規定。

1.2 主要試劑與儀器

黃芪甲苷溶液配制：取黃芪甲苷干粉溶解于1%的羧甲基纖維素鈉溶液中,制成0.3 mg/mL的黃芪甲苷混懸液備用。地塞米松溶液配制：用蒸餾水將地塞米松配制成0.5 mg/mL溶液備用。

TLR4 抗體、P-38 抗體、p-p38、RIPA(強)組織細胞快速裂解液,BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)、蘇木素、伊紅購自bioswamp公司,貨號分別為：PAB33926、 PAB40560、 PAB43320-P、 W1689、W1712、I1709、I1703;黃芪甲苷、地塞米松、羧甲基纖維素鈉購自 aladdin公司,貨號分別為：A111275、D137736、C104979;LPS、戊巴比妥鈉購自 sigma公司,貨號分別為：L3012、P3761;SYBR Green PCR 試劑盒購自 KAPABiosystems公司,貨號：KM4101;逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司,貨號：639505。

電泳儀、熒光定量PCR儀,美國BIO-RAD公司,型號分別為：mini protean 3 cell、CFX-Connect 96;酶標儀,芬蘭雷勃公司,型號：MK3;全自動化學發光分析儀,上海天能科技有限公司,型號：TanoN-5200;凝膠成像系統北京君意東方電泳設備有限公司;正置顯微鏡、石蠟切片機,德國徠卡顯微系統有限公司,型號分別為：DM1000、TKD-TK;組織脫水機、石蠟包埋機,湖北康強醫療器械有限公司,型號：TKD-TSB、Tb-718D。

1.3 實驗方法

1.3.1 新生小鼠肺損傷模型構建

新生7 d小鼠稱重,腹腔注射LPS(5 mg/kg,加生理鹽水至0.5 mL),對照組腹腔注射等量生理鹽水(0.5 mL)。

1.3.2 模型鑒定

造模12 h后,取幼鼠肺組織進行組織病理學檢測,觀察肺部是否有明顯病變。并根據肺間質水腫、肺泡水腫、炎細胞浸潤、肺泡出血、充血、肺不張改變的等級,按程度的“無、輕、中、重”分別計“0、1、2、3分”,然后累計總分,評分越高表示病理變化越嚴重[16]。

1.3.3 分組及給藥方式

模型組：幼鼠在造模前1 h灌胃給予10 mL/kg的1%羧甲基纖維素鈉,然后進行造模處理;黃芪甲苷組：幼鼠在造模前1 h灌胃給予黃芪甲苷溶液(10 mL/kg),然后進行造模處理[17];陽性對照組：幼鼠在造模前灌胃給予地塞米松(10 mL/kg),然后進行造模處理[18];對照組灌胃給予0.5 mL滅菌生理鹽水,造模12 h取幼鼠肺組織。

1.3.4 HE切片制作

幼鼠肺組織固定在10%中性福爾馬林中2 d;修塊：厚度約為 0.2～0.3 cm,大小為 1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm;沖水：12 h;脫水：組織脫水機內進行;浸蠟;包埋;切片;染色：將組織切片常規脫蠟至水,蘇木精液染色5 min,1%鹽酸乙醇2 s,流水沖洗15 min,0.5%伊紅液染色2 min,蒸餾水洗2 s,80%乙醇30 s,95%乙醇30 s,無水乙醇1 s,二甲苯(Ⅰ)2 s,二甲苯(Ⅱ)2 s,中性樹膠封固。通過顯微鏡拍照,Leica Application Suite圖象系統采集分析樣本。

1.3.5 Western blot檢測

用研磨器將收集的肺組織研碎,收集細胞,加入適量預冷的1×PBS洗滌,加入裂解液充分裂解細胞,離心后取上清液進行蛋白質濃度測定。然后用12%的分離膠,5%的濃縮膠進行蛋白質電泳、90 V轉膜50 min、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h、孵育TLR4、p38、p-p38抗體(1∶2000稀釋)和 GAPDH 抗體(1∶1000稀釋),37℃孵育2 h,洗滌3次,加羊抗兔二抗IgG(1∶20000稀釋)37℃孵育1 h,洗滌3次,然后將膜放置在暗室中,根據用量取ECL發光液A和B等量混勻,加在膜的正面與之充分接觸。然后將膜置于全自動化學發光分析儀中檢測。

1.3.6 qRT-PCR檢測

用研磨器將收集的肺組織研碎,收集細胞,用TRIzol法提取各組細胞總RNA,采用分光光度計測定RNA濃度和純度,將mRNA反轉錄成cDNA。以逆轉錄后cDNA為模板,分別擴增看家基因和目的基因。PCR條件：94℃預變性4 min,94℃變性5 s,56℃退火10 s,72℃延伸25 s,共39個循環,65℃7 min,95℃ 50 s。 用2-△△Ct法計算目的基因與看家基因的比值。引物序列見表1。

1.4 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計學處理,計量資料采用平均數±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。使用Graphpad prism 5軟件制作統計圖。

2 結果

2.1 模型鑒定

造模12 h后,幼鼠肺呈現：間質充血、出血(圖1左),肺水腫,肺泡間隔明顯增寬,大量肺泡萎陷,肺部正常組織形態結構消失(圖1右)。

表1 Real-time PCR檢測引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequence

2.2 黃芪甲苷對SD幼鼠肺組織病理學的影響

幼鼠肺組織切片顯示,對照組肺泡形狀完好,未見充血、炎癥細胞浸潤、水腫等病理現象(圖2A、2a);模型組在建模后12 h呈現肺出血、肺泡腔內有炎性細胞浸潤,大量肺泡萎陷(圖2B),24 h呈現肺水腫,肺泡間隔明顯增寬,充血(圖2b)。和模型組相比,黃芪甲苷組在12 h,僅呈現輕微的肺泡壁增厚,輕微充血(圖2C),24 h也僅表現輕微的肺泡壁增厚(圖2c)。地塞米松組病變程度較模型組顯著減輕(圖 2D、2d)。

模型組病理形態學積分與對照組有極顯著性差異(P＜0.001),表示建模成功,另外,黃芪甲苷組,地塞米松組與模型組有顯著性差異(P＜0.05),見表2。

2.3 黃芪甲苷對 SD幼鼠肺組織中 TLR4-p38 MAPKs信號通路蛋白表達的影響

從Western blot結果可以看出,模型組TLR4和p-p38蛋白相對表達量和對照組相比,明顯升高(P＜0.05,P＜0.01)。黃芪甲苷組TLR4和p-p38蛋白相對表達量和模型組相比,均有明顯的降低(P＜0.05,P＜0.001),見圖 3。

2.4 黃芪甲苷對 SD幼鼠肺組織中 TLR4-p38 MAPKs信號通路核酸表達的影響

由q-PCR結果可以看出,模型組TLR4和P38相對表達量均高于對照組(P＜0.05)和地塞米松組(P＜0.05),模型組TLR4相對表達量和黃芪甲苷組相比,明顯升高(P＜0.05),見圖4。

2.5 黃芪甲苷對SD幼鼠肺組織中炎癥因子表達的影響

由qRT-PCR結果可以看出,和模型組相比,在注射黃芪甲苷后,TNF-α、IL-6、IL-12各炎癥因子均有下降的趨勢,其中模型組IL-12 mRNA相對表達量與地塞米松組和黃芪甲苷組有顯著性差異(P＜0.05),見圖 5。

圖1 急性肺損傷小鼠肺組織切片Figure 1 Lung section of mice with acute lung injury

表2 幼鼠肺組織病理形態學積分的變化(±s,n=6)Table 2 Pathomorphological changes of the lung tissues in rats

表2 幼鼠肺組織病理形態學積分的變化(±s,n=6)Table 2 Pathomorphological changes of the lung tissues in rats

注：與對照組比較,###P＜0.001;與模型組比較,*P＜0.05。Note.Compared with the control group,###P＜0.001.Compared with the model group,*P＜0.05.

組別Groups 病理學積分Pathology score對照組 Control group 1.71±1.18###模型組 Model group 14.5±2.42黃芪甲苷組 Astragaloside group 7.62±2.28*地塞米松組 Dexamethasone group 8.46±3.14*

圖2 小鼠肺組織病變Note.Figure A-D represents the lung sections of the 12 h control group,model group,astragaloside group,and dexamethasone group.a-d represents the 24 h control group,model group,astragaloside group,and dexamethasone group.Figure 2 lung tissue Lesions in mice

圖3 TLR4-p38 MAPKs信號通路蛋白表達Note.A,Relative expression of TLR4 protein.Compared with the control group#P＜0.05.Compared with the model group,*P＜0.05.B,Relative expression of p-p38 protein.Compared with the control group,##P＜0.01.Compared with the model group,***P＜0.001.Compared with the dexamethasone group,&&P＜0.01.C,TLR4-p38 MAPKs signaling pathway protein expression,1-4 show the control group,model group,astragaloside group,and dexamethasone group.Figure 3 TLR4-p38 MAPKs signaling pathway protein expression

圖4 TLR4-p38 MAPKs信號通路核酸表達Note.A,Relative expression of TLR4 mRNA,the 4 bars in the figure show the control group,model group,astragaloside group,dexamethasone group.Compared with the control group,#P ＜0.05.Compared with the model group,*P ＜0.05.Compared with the dexamethasone group,&P＜0.01.B,Relative expression of p38 mRNA.Figure 4 TLR4-p38 MAPKs signaling pathway nucleic acid expression

圖5 炎癥因子表達Note.A,Relative expression of TNF-α mRNA.B,Relative expression of IL-12 mRNA.Compared with the model group,*P ＜0.05.Compared with the dexamethasone group,&P＜0.01.C,Relative expression of IL-6 mRNA.Figure 5 Expression of inflammatory factors

3 討論

ALT是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷,造成彌漫性肺間質及肺泡水腫,導致的急性低氧性呼吸功能不全。大多數患者在臨床上有急性呼吸窘迫綜合征急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ALT病死率高,有研究表明該病病死率高達44.3%[19]。ALT在病理學上表現為彌漫性肺泡損傷、肺泡毛細血管通透性增加,隨著病情進展導致間質性肺炎和肺纖維化[20]。造成ALT的原因有很多,比如感染、膠原血管疾病、藥物不良反應、休克、急性嗜酸性粒細胞肺炎、免疫介導的肺出血和血管炎、放射性肺炎等[21]。其中革蘭陰性桿菌感染是引起ALI的常見因素。細胞壁的LPS是革蘭陰性桿菌內毒素的主要成分,也是最主要的致病因素[22]。本研究用LPS誘導,建立SD幼鼠急性肺損傷模型,ALI的病理基礎與肺內失控的炎癥反應所致的肺毛細血管膜損傷,肺水腫及透明膜形成有關[23]。本研究結果顯示,黃芪甲苷組小鼠肺病變,和模型組相比,充血、出血、水腫、炎性細胞浸潤的情況明顯減輕,這說明黃芪甲苷能有效緩解LPS造成的SD小鼠的肺部損傷。

MAPKs是細胞內廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,可參與多種細胞反應的調節,如細胞增殖分化、凋亡、癌基因轉化等[24-25]。p38MAPK信號通路參與類風濕性關節炎、哮喘等多種炎癥疾病的發生過程,是一種重要的炎癥調控因子[26-27]。黃芪多糖抗炎作用機制與抑制p38MAPK信號通路有關,目前在哮喘氣道炎癥、心臟炎癥等炎癥發生中已經證實[28-29],且有報道稱TLR4可激活MAPKs信號通路[6],本研究中,發現黃芪甲苷能有效降低TLR4和p-p38的表達量。炎癥因子在炎癥反應中起決定性作用,在急性腎損傷早期,IL-1β能夠通過提高白細胞CD11/CD18的表達水平、促進內皮細胞ICm-1表達等方式召集炎癥細胞進入腎間質[30]。TNF-α也是一種促炎因子,其在急性組織損傷中表達上調,TNF-α能夠促進炎癥發生[31]。在慢性肺炎中IL-6也對病情的發展起重要作用[32]、IL-12也是重要的炎癥因子[33]。有報道稱,黃芪甲苷可能通過MAPK/ERK通路促進LPS誘導的BMSCs增殖,抑制其凋亡和促炎細胞因子的分泌[34]。本研究結果發現,黃芪甲苷組炎癥因子的表達量有所降低,其中IL-12和模型組有顯著性差異,這表明黃芪甲苷能有效抑制炎癥因子的表達,進而抑制機體產生過強的炎癥反應,來保護由LPS造成的SD小鼠的肺損傷。

綜上所述,黃芪甲苷能減輕SD小鼠肺病變程度,抑制TLR4和p-p38的表達水平,降低炎癥因子TNF-α,IL-6,IL-12的表達量,表明黃芪甲苷可能通過抑制TLR4-p38MAPK信號通路發揮抗炎癥反應和緩解肺損傷的作用。