實驗魚生物餌料的質量控制

李建軍蔡 磊余露軍黃 韌

(廣東省實驗動物監測所,廣東省實驗動物重點實驗室,廣州 510663)

實驗動物飼料質量是與實驗動物質量密切相關的重要條件,也是保證動物實驗順利進行和實驗結果準確可靠的基礎。實驗魚個體小,口徑小,其微粒飼料應滿足下列基本條件：1)符合實驗魚攝食習性、生理機能及不同生長時期的營養需求;2)水中穩定、懸浮、不結團,粒徑合適;3)誘食,易被發現和捕食;4)適口,易消化吸收[1]。近年來國內外微粒飼料的配方和制備工藝技術雖取得一定進步,但仍無法達到生物餌料飼喂的生長率和存活率[2]。生物餌料指經過人工篩選的、可進行人工培養且適合養殖對象采食的生物,其具有適口、營養豐富、增殖快、增強抗病能力、對水質污染小等特點[3],被公認為是當今及今后較長時間內實驗魚的主要飼料。

1 生物學特性

目前實驗魚的主要生物餌料有：大草履蟲(Paramecium caudatum)、褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)和鹵蟲(Artemia salina)等。

草履蟲是浮游動物的重要組成部分,具有分布廣、個體大、易培養、繁殖快等特點[4],是斑馬魚等許多水生經濟動物幼體的開口餌料。目前世界上已報導草履蟲22種,我國草履蟲常見種為大草履蟲(又稱尾草履蟲),隸屬于纖毛綱(Ciliata)、膜口目(Hvmenostomatida)、咽膜亞目(Peniculina)、草履蟲科(Parameciidae)、草履蟲屬(Paramecium)。大草履蟲長180～280μm,繁殖適溫10℃～30℃,生長最適溫度25℃;適宜pH值5.0～10.0,中性略偏酸環境生長較好,常在有機質較多的死水或緩流中生活[5-6]。

輪蟲屬輪蟲動物門(Rotifera)、輪蟲綱(Rotifera)、真輪亞綱(Eurotatoria),其大小適宜、營養豐富、適應性強、繁殖快、易大量培養,是一種重要的水生動物餌料[7]。其中使用最廣泛的皺褶臂尾輪蟲,大小在150～360μm之間,分為 L型和S型[8]。

鹵蟲屬節肢動物門(Phylum Arthropoda)、有鰓亞門(Subphylum Branchiata)、甲殼綱(Class Crustacea)、鰓足亞綱(Subclass Branchioplda)、無甲目(Order Anostraca)、鹽水豐年蟲科(Family Branchinectidae)、鹵蟲屬(Artemia)[9]。無節幼體長500～700μm、寬180～250μm,不同品系大小略有差異;世界各大陸的鹽湖、鹽田等高鹽水域中均有分布,傳播的主要媒介為風和水鳥;幼蟲適鹽范圍為20～100,成蟲為 10～25;耐溫范圍 6℃ ～35℃,生長最適溫度25℃～30℃;可耐1 mg/L低氧,也能生活于1～1.5倍飽和氧環境;孵化用水pH值8～9為宜,低于8孵化率降低;主要濾食50μm以下的顆粒,5～16μm的顆粒攝食率較高,天然環境中以細菌、微藻和有機碎屑等為食。

2 營養成分

2.1 主要營養成分含量

草履蟲營吞噬營養,細胞質中含有蛋白質、多糖和脂類等物質,含水率75%～85%。

褶皺臂尾輪蟲體內蛋白質含量占干重28%～63%,脂類占9%～28%,面包酵母培養的輪蟲,其總脂類含量較低,延長藻類或經脂類強化的酵母的投喂時間可提高輪蟲脂類含量[10]。

脫殼后鹵蟲卵、初孵無節幼體和養殖成蟲的總蛋白質含量分別為43%～57%、54.6%～59.9%和55.6%～58.2%[11];鹵蟲卵總脂肪含量為17.98%,去殼卵粗脂肪含量16.64%,初孵無節幼體脂肪占干重的20.84～23.53%。鹵蟲卵及其初孵無節幼體含較多的棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞麻酸、亞油酸。成蟲除含有大量的不飽和脂肪酸外,還含較多維生素、胡蘿卜素、抗壞血酸。鹵蟲休眠卵內甘油和海藻糖分別占干卵重的5%和15%～17%[12]。

2.2 營養成分影響因素

草履蟲培養液的制備方法有多種,主要包括：稻草培養法、玉米培養液法、酵母片培養液法、沼液培養液法、麥粒培養液法及其他培養液法,另外,西瓜皮、香蕉皮、香瓜皮、桃子皮等材料以及池沼的禾本科植物或當年的禾本科農作物均可培養出草履蟲[13]。玉米穗、玉米粒培養液因營養豐富,能產生大量細菌,利于草履蟲繁殖,培養效果較好。而荷葉、槐葉營養成分低,新鮮荷葉、槐葉在晾干過程中可能產生不利于細菌生長的物質,培育效果欠佳。

天然環境中的輪蟲和鹵蟲營養價值全面。酵母培養的輪蟲大多缺乏N-3系列高度不飽和脂肪酸,特別是EPA和DHA,而海洋微藻中EPA、DHA含量較高,因此可選用N-3系列不飽和脂肪酸含量豐富的藻種如三角褐指藻、新月菱形藻、纖細角毛藻、球等鞭金藻、小球藻、微綠球藻等對酵母輪蟲進行營養強化[14]。

鹵蟲的營養成分與其品系、發育階段、生存環境(特別是餌料條件)等因素有關[11]。鹵蟲生長發育時,其體內的蛋白質含量逐漸增加,且隨所攝取的餌料等因素的變化而變化。不同品系鹵蟲蛋白質含量不同。脂肪酸的組成及含量是影響鹵蟲營養價值的主要指標[15]。不同品系鹵蟲脂肪酸含量不同,18 ∶3ω3、18 ∶4ω4、20 ∶5ω5 含量尤其差別大[16]。鹵蟲卵孵化是體內營養物質不斷消耗的過程,其脂肪酸含量逐漸減少,特別是卵磷脂。即使是同一品系的鹵蟲卵,孵化條件不同,無節幼體含有的能量也不同。低鹽高溫孵化,鹵蟲初孵無節幼體含有的能量較多[12]。

3 有毒有害物質

Mansouri-Aliabadi等[17]研究表明,重金屬(鋅、鎳和鉛)可通過食物傳遞到草履蟲;陳偉琪等[18]研究也顯示,藻類、輪蟲等海洋生物都能直接從海水中吸收銅,銅可沿著海水→扁藻→輪蟲→仔蝦進行傳遞;大連灣海域浮游生物體內Pb和Cd含量超過生物污染評價標準[19]。欽州灣東部海域浮游生物Cd、Hg含量達 1.51×10-1mg/kg干重、9.48×10-3mg/kg干重,遠高于水體含量,呈現出重金屬從水體到浮游生物的遷移轉化規律,浮游生物對重金屬的富集系數最高達40 000,表明浮游生物對重金屬有很強的富集能力[20]。因此,野生環境下的生物餌料(如草履蟲、輪蟲、鹵蟲)可富集水環境中的重金屬等多種有毒有害物質,在使用生物餌料時應對其有毒有害物質含量進行檢測評價。

由于各種來源的生物餌料質量良莠不齊,目前已有相關標準對生物餌料有毒有害物質進行規定,如DB13/T 787-2006《褶皺臂尾輪蟲土池養殖技術規范》[21]和 DB13/T 789-2006《鹵蟲養殖技術規范》[22]要求作為生物餌料的輪蟲和鹵蟲有毒有害物質含量應嚴格低于NY 5073《無公害食品 水產品中有毒有害物質限量》[23]的規定。實踐表明,實驗室培育的草履蟲、輪蟲和質量較好的鹵蟲,其有毒有害物質含量可符合NY 5073《無公害食品水產品中有毒有害物質限量》[23]的要求(表1),風險可控。

4 攜帶病原

國內外已有較多關于生物餌料可能攜帶致病微生物的報道,如鹵蟲卵和輪蟲休眠卵可通過PCR方法檢測到WSSV陽性[24-25];宋曉玲等[26]研究也顯示橈足類、鹵蟲等可檢出WSSV;何建國等[27]通過人工感染和PCR方法證明橈足類是WSSV的宿主,而且進一步證明橈足類是WSSV等病毒傳播的媒介生物之一。同時,生物餌料也是弧菌的重要攜帶者,Thompson等[28]、Gomezgil等[29]從海水輪蟲中分離到多種弧菌;吳崗等[30]從市售鹵蟲分離到3種優勢弧菌;Bergh等[31]、Alvise等[32]研究表明鹵蟲和輪蟲可傳播水產上危害極大的鰻弧菌。鑒于生物餌料存在攜帶病原微生物風險,許多學者提出了加強鹵蟲卵等生物檢驗檢疫的方法和策略,但尚無專門的病原檢疫程序[33]。

國內外已有學者成功培育無菌輪蟲和無菌鹵蟲[34-35],但生產上更多的是采用臭氧、消毒劑等方法消毒或益生菌定植培養等方法對輪蟲、鹵蟲等生物餌料的致病微生物進行控制,并取得了非常理想的效果[36-37]。從上述研究結果可知,使用生物餌料時應對其病原微生物進行檢測和評價,經嚴格消毒控制或凈化培育的草履蟲、輪蟲、鹵蟲等生物餌料攜帶病原風險可控。

5 推薦生物餌料質控要求

5.1 草履蟲培育

5.1.1 草履蟲引種時的純化

將含有草履蟲的液體吸入表面皿(或凹玻片)中,在顯微鏡或解剖鏡下檢查,用直徑約0.2 mm的微吸管將表面皿(或凹玻片)中的草履蟲逐個吸出(必要時用超純水或去離子水反復稀釋、沖洗)培養。

表1 實驗室培育褶皺臂尾輪蟲和鹵蟲有毒有害物質檢測結果(mg/kg)Table 1 Detection results of toxic and harmful substances in Brachionus plicatilis and Artemia salina cultured in laboratory

5.1.2 草履蟲的培養

將純培養的草履蟲倒入至500 mL或1000 mL燒杯中,加適量除氯的自來水,每天滴加1～2滴新鮮配制濃度為0.9～3.0 g/L的酵母原液,在水溫22℃～28℃、pH值6.5～7.5的條件下培養。培養過程盡量保持環境因子恒定。

5.1.3 草履蟲的收集投喂

當培養液中草履蟲密度較大時,收集培養液表面的草履蟲,用仔魚養殖水沖洗(必要時用300～500目篩絹過濾),稀釋至每毫升100～150個的密度投喂。

5.2 褶皺臂尾輪蟲培育

5.2.1 褶皺臂尾輪蟲的純化

將含有褶皺臂尾輪蟲的液體吸入表面皿(或凹玻片)中,在顯微鏡或解剖鏡下檢查,用直徑約0.5 mm的微吸管將表面皿(或凹玻片)中的褶皺臂尾輪蟲逐個吸出(必要時用滅菌海水反復稀釋、沖洗)培養。

5.2.2 褶皺臂尾輪蟲的培養

培養用水需經砂濾、300目的篩絹網過濾或其他方式處理以除去小型甲殼動物等敵害生物。鹽度15～25,pH 值 7.5～8.5,溫度 25℃ ～30℃,溶氧2.0 mg/L以上,非離子氨1.0 mg/L以下,光照強度500 lx左右,可連續照明,也可間隔照明(如光暗周期為18∶6),或自然光照。

接種褶皺臂尾輪蟲的密度每毫升不宜小于0.1個。宜采用海水小球藻培養,藻類密度約保持為每毫升2.0×106個細胞。如以酵母培養,投喂魚苗前應采用海水小球藻進行營養強化24 h以上。連續充氣,充氣量不宜過大。經常檢查輪蟲的生長情況,輪蟲死殼多,身體上附著污物,沉底、不活潑、不帶卵或帶冬卵為不良情況,應改進培養方法。

5.2.3 褶皺臂尾輪蟲的投喂

投喂前經60目篩絹網過濾除去藻渣等雜質,300目篩絹網收集輪蟲。

5.3 鹵蟲孵化與投喂

5.3.1 鹵蟲卵的質量要求

可購買商品卵。鹵蟲卵孵化率≥80%,含水率≤8.0%,雜質≤1.0%。檢驗按SN/T 0476的規定執行。運輸過程中應防止包裝破損、日曬、雨淋。鹵蟲卵應在低溫(-20℃～4℃)、干燥、避光、密封環境下貯存。嚴禁與有毒、有害物品混合存放。開罐后鹵蟲卵應盡快使用。

5.3.2 鹵蟲卵的孵化

孵化前用2%～3%的福爾馬林浸泡10～15 min,或次氯酸鈉(有效氯達20 mg/L)溶液浸泡30 min,然后用清水沖洗,也可采取其他消毒方法。孵化密度不宜超過每升3.0 g干重。水溫25℃～30℃、鹽度10～30、pH7.5～8.2,光照 1000 ～3000 lx,溶解氧大于5.0 mg/L。連續充氣,充氣量以能把容器底部的蟲卵充分吹起并使卵均勻分布為宜。

5.3.3 鹵蟲的投喂

投喂前去除空殼和未孵化的鹵蟲卵,用150目篩絹網袋收集、沖洗鹵蟲無節幼體。幼體孵出后24 h內投喂。也可投喂經清洗的脫殼鹵蟲卵。

6 小結

綜上所述,大草履蟲、褶皺臂尾輪蟲、鹵蟲等浮游生物大小適宜,營養豐富,增殖迅速,便于實驗室培養,對水質污染小,按質量控制要求培養攜帶病原和有毒有害物質風險可控,是實驗魚的優良餌料。