斑馬魚魚房和養殖系統建設標準

李闊宇潘魯湲孫永華

(中國科學院水生生物研究所,淡水生態與生物技術國家重點實驗室,國家斑馬魚資源中心,武漢 430072)

近三十年來,斑馬魚因具有諸多生物學優勢,例如性成熟周期短、產卵量大、體外受精、胚胎透明和體外發育等,已經發展成為一種重要的脊椎動物模式生物,在發育生物學、遺傳學、環境毒理學和水產遺傳育種工程等眾多的研究領域得到了廣泛地應用,被譽為水中小白鼠[1-3]。根據國際斑馬魚信息中心網站數據,全球已有超過1300多個活躍的斑馬魚實驗室[4]。隨著斑馬魚研究實驗室數量的快速增長,斑馬魚養殖標準化的問題日益凸顯。國內外目前仍然沒有制定關于斑馬魚模式生物養殖標準化的規章制度。

斑馬魚的生物學特征以及生長繁殖環境已經得到了深入且系統的研究[5-14]。這些研究結果對實現斑馬魚的人工標準化養殖具有極高的參考價值。斑馬魚作為一種模式生物,其實驗室的人工養殖沒有像實驗動物,例如小白鼠等,建立了完整的和系統的實驗動物標準。國內外的許多實驗室多參考國際斑馬魚資源中心所推薦養殖標準,進行實驗室人工養殖。我國的斑馬魚研究工作者在積極探討斑馬魚的實驗動物標準化。2015年,廣東省實驗動物監測所和中國科學院水生生物研究所(國家斑馬魚資源中心)等單位開展合作,開展斑馬魚遺傳、營養、環境、病原等質量控制的國家標準化工作。鑒于斑馬魚的實驗室養殖缺乏標準化,導致其養殖基礎設施的建設也存在建設標準化的問題。目前,斑馬魚的實驗室人工養殖基礎設施建設呈現多樣化,有些實驗室通過自行設計和搭建的方式,建設個性化的養殖基礎設施。有些實驗室通過與商業的斑馬魚養殖基礎設施生產商合作的方式,建設斑馬魚養殖基礎設施。對于新成立的斑馬魚實驗室來說,如何合理地規范地建設斑馬魚養殖系統,即斑馬魚魚房,是所面臨的第一個重要問題。關于斑馬魚魚房建設的相關報導較少。Kim等[15]通過傳統的手工工藝,組建了簡易的斑馬魚養殖系統。其優點是低成本,系統簡單和便于日常維護。但是,該系統不具備自動化功能,不能為斑馬魚生長繁殖提供穩定的養殖環境;養殖規模小,且不能擴容,增加養殖容量。因此,該方法不易推廣和借鑒。McNabb等[16]討論了斑馬魚魚房的結構和養殖環境要求等內容。但是,對于如何建設新的斑馬魚魚房卻沒有涉及。斑馬魚魚房作為維持斑馬魚養殖正常運轉和開展斑馬魚實驗所必需的基礎條件,不僅為斑馬魚的健康生長和繁殖提供了適宜的和穩定的養殖環境,而且也可以滿足研究人員的研究需要,為斑馬魚的實驗動物標準化奠定了堅實的基礎。

本文系統地闡述了斑馬魚魚房的建設,包括斑馬魚規模化自動養殖系統,以及相配套的魚房結構規劃和室內配套裝修工程等相關內容。幫助斑馬魚研究人員規范地和合理地建設斑馬魚魚房。

1 大型斑馬魚中央循環養殖系統

大型斑馬魚中央循環系統由多個結構和功能不同的模塊構成。如圖1所示,該系統具體包括供水純化模塊,純水水質自動化調控模塊,斑馬魚養殖水凈化模塊,養殖水動力循環模塊,養殖水自動化控制即自動化養殖安全模塊,和斑馬魚養殖模塊。該系統具有自動化運行,養殖容量大和運行成本低等諸多優點。其最大養殖容量可達近3萬尾成年斑馬魚(5尾/升養殖密度計)。適用于科研院所大型斑馬魚養殖共享平臺的建設。

圖1 大型斑馬魚中央循環系統結構圖Figure 1 Schematic structure of zebrafish central circulation system

1.1 供水純化模塊

斑馬魚養殖用水來源于市政供水。自然界水源經過沉淀,過濾,消毒殺菌等工藝處理后達到國家生活飲用水標準[17-18]。市政生活飲用水含有微量的無機物,有機物,微生物等雜質[19]。對斑馬魚生長繁殖存在潛在的不利影響。供水純化模塊通過物理過濾(微濾棉和石英砂)、活性炭吸附和反滲透膜過濾,可對市政飲用水進行二次純化,去除水中可能含有的泥沙、鐵銹、細菌、懸浮物、藻類、微量重金屬元素,和大分子有機物等多種有害物質。經過供水純化模塊純化后的水質達到如下標準[20]：

脫鹽(salt rejection)95%～98%

有機分子截留(organic rejection)＞150 MW

除菌(bacteria rejection)99%

除顆粒物(particle rejection)99%

電導率(conductivity)＜30μS/cm。

1.2 純水水質自動化調控模塊

供水純化模塊純化后的水在溫度、酸堿度(pH)、硬度和滲透壓等方面不適宜于斑馬魚的生長繁殖,需要經過純水水質自動化調控模塊的調整。使水質符合斑馬魚生長繁殖的要求。水質調控模塊是利用工業自動化的技術實現水質的調控。具有自動化,數字化和程序化等功能。用戶根據斑馬魚養殖需要,編寫或修改水質調控模塊。模塊會按照用戶所上載的程序,自動調整純水的溫度、pH、溶氧度、滲透壓和硬度等。同時,水質調控模塊具有實時在線檢測水體的溫度、pH、溶氧度、滲透壓和硬度等水質參數的功能。用戶可以通過互聯網遠程登陸訪問純水水質自動化調控模塊。

1.3 斑馬魚養殖水凈化模塊

食物殘屑和斑馬魚排泄物是引起斑馬魚養殖系統水質惡化的主要原因。養殖水體中的氨氮是導致斑馬魚疾病和死亡的主要化合物。水體中的有機廢物的不僅導致細菌的大量滋生,而且會導致水體中氨氮濃度的升高,以及溶氧度和pH的降低[21]。斑馬魚養殖水凈化模塊通過物理、化學和生物的方法,有效地去除養殖水體中的顆粒懸浮有機廢物和可溶性物質,降低氨氮濃度,以及抑制水體中細菌大量滋生,具有凈化養殖水質的功能。該模塊按結構和功能包括物理過濾單元、生物凈化單元和殺菌抑菌單元。

1.3.1 物理過濾單元

物理過濾單元可以有效地去除養殖水體中的懸浮顆粒及其它有害廢棄物。該單元由固定過濾篩和活性炭過濾篩組成。在斑馬魚養殖中,魚類的糞便及其所食餌料的20%～60%最終以固體廢棄物的形式進入養殖循環水體中。其中,約一半以上是懸浮性固體顆粒物,是養殖水體污染物的主要來源。固定過濾篩網能夠有效過濾水體中直徑≥50μm的固體顆粒。活性炭過濾篩能夠有效地將養殖水體中的可溶性有機雜質吸附到活性炭顆粒內,從而達到去除有機物質的目的。但是,活性炭的吸附能力會隨著使用時間不同程度地減弱,吸附效果也隨之下降。養殖水質混濁,有機物含量高,則活性炭短時間內喪失過濾功能。活性炭顆粒的大小對吸附能力也有影響,活性炭顆粒越小,吸附表面積就越大。粉末狀的活性炭總面積最大,吸附效果最佳。然而,粉末狀的活性炭易隨水流入水族箱中,難以控制,很少采用。顆粒狀的活性炭因顆粒成形不易流動,水中有機物等雜質在活性炭過濾層中也不易阻塞,其吸附能力強,已廣泛地應用于斑馬魚循環養殖系統。

1.3.2 生物凈化單元

斑馬魚養殖過程中,所產生的的氨氮可以通過生物凈化單元,即生物膜反應器去除。在溶氧充足的水體中,有機廢物在氨化細菌的作用下,進行有機氮化合物的脫氨基作用,生成氨態氮,即氨化作用;氨氮在亞硝化單胞菌和硝化單胞菌的作用下,使氨氮轉化成亞硝酸鹽再轉化成硝酸鹽的過程,即硝化作用[22]。目前,常用的脫氨方法是在生物過濾器上附著生物膜進行脫氮。生物膜是一穩定的、多樣的微生物生態系統。懸浮于液相中的有機污染物及微生物移動并附著在載體的表面上;然后附著在載體上的微生物對有機物進行降解,并發生代謝、生長、繁殖。生物膜反應器分為固定床和流化床兩類。斑馬魚循環養殖系統中最常用的是固定床生物濾器。在固定床中生物膜載體固定不動,在反應器內的相對位置基本不變;在流化床中生物膜載體不固定,在反應器內處于連續流動的狀態。

1.3.3 殺菌單元

斑馬魚循環養殖系統通常使用紫外燈殺菌。紫外燈發射波長在200～300 nm范圍的紫外線,都有殺菌能力。其中以265～266 nm的殺菌力最強,在波長一定的情況下,紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。可以穿透細菌的細胞膜,被細胞核吸收,對細菌DNA造成損傷,抑制了DNA的復制,破壞了菌體的繁殖能力,從而達到了殺菌的目的。但是紫外線殺菌需要穿透水層才能起作用,因為污水中的懸浮物、濁度等都會干擾紫外光的傳播。所以養殖水的水質是保證紫外線消毒的先決條件[23]。

1.4 養殖水動力循環模塊

養殖水動力循環模塊能夠為斑馬魚養殖水體的循環提供基本的動力。該模塊核心組件循環水泵采用三相電驅動,能夠為養殖水在系統內周而復始地循環體提供動力。大功率循環水泵(＞15 kw)在啟動過程中,會對電控網產生沖擊,同時出現水錘效應,易損壞養殖系統和縮短系統的壽命。因此,循環水泵的啟動一般采用軟啟動、降壓啟動或者變頻啟動多的方式,避免對系統產生不利影響[24]。動力循環模塊在結構設計上需采用水流旁路,能夠在不關閉主水泵情況下進行系統維護(例如更換UV燈管,清潔pH探頭和更換過濾器等);循環水泵提供的水循環速率應滿足每個養殖缸的水被更換次數不少于每小時5次;該模塊宜采用雙循環水泵,一用一備。在主水泵不能工作時,備用水泵能夠立刻自動工作;循環水泵有減震設計。

1.5 自動化養殖安全模塊

自動化養殖安全模塊利用現代工業自動化技術為斑馬魚養殖提供適宜的生長環境,是斑馬魚養殖健康和安全的核心模塊。水質調控單元具有實時監測和調控斑馬魚養殖水的理化性質。調控的基本項目有：溶氧度、鹽度、溫度、pH值。保證這些水質指標都控制在養殖對象的適應范圍內。一般要求斑馬魚養殖水體的溶氧不低于在6.0 mg/L之間,pH值在7～8之間,電導率在500～800μS/cm。養殖系統對于以上指標應能夠實時自動監測,發現某個指標異常,須即時自動調整。同時,該模塊具有實時監控報警功能。當養殖系統中儀器不能正常工作,或者養殖系統水質超出設定范圍時,能夠自動報警;當養殖系統中儀器不能正常工作時,自動化控制單元能夠自動啟動備用儀器。

1.6 斑馬魚養殖模塊

斑馬魚養殖模塊主要包括斑馬魚養殖架和養殖缸。養殖架的制作采用堅固和耐腐蝕316 L材質不銹鋼。架體底部設計有水平調節的底腳調節螺絲。機架可根據斑馬魚房地面坡度進行調節;養殖架整體及各層都能實現養殖水流量控制。給排水管道(含閥門)易于維修和更換。

斑馬魚養殖缸多采用優質塑料(例如聚碳酸酯,聚砜樹脂)一次性注塑成型,耐高溫(≤121℃)消毒,抗摔性強。缸體為無色透明,蓋板及插板為藍色。蓋板表面有喂食孔、水管卡孔。插板與養殖槽底部留有縫隙,缸底的有機沉淀物可有效地通過虹吸作用被清除,避免缸內水質腐化,危害斑馬魚生長。針對斑馬魚不同的生長階段,養殖缸配備相應的插板。當養殖斑馬魚幼魚時,需要使用不同孔徑的幼魚插板。幼魚專用插板底部與水槽貼合無縫隙,水流從幼魚專用插板的尼龍濾網處流出,防止幼魚被水流沖走。每個養殖缸的供水單獨可控;每排養殖缸的供水單獨可控。

2 斑馬魚魚房的規劃設計

2.1 斑馬魚房選址

斑馬魚房選址應避開自然疫源地;宜環境安靜,遠離鐵路、碼頭、飛機場、交通要道等有嚴重震動或噪聲污染的區域;宜環境空氣質量較好,遠離散發大量粉塵和有害氣體的工廠、倉庫、堆場;應遠離易燃、易爆物品的生產和儲存區,并遠離高壓線路及其設施;宜建設在建筑物的底層。

2.2 斑馬魚房基礎設施的建筑要求

貨物出入口應設置坡道或卸貨平臺,坡道坡度不應大于1/10。應充分考慮空調機、通風機等設備的面積需求,并對噪音和震動進行處理。樓層在二層以上的斑馬魚房設施宜設置貨梯。樓梯寬度不宜小于1.2 m,走廊凈寬不宜小于1.5 m,門寬度不宜小于1.0 m,高度不低于為2.1 m。樓層高不宜小于3.5 m。室內凈高不宜低于2.4 m,并應滿足設備對凈高的需求。

墻面和頂棚的材料應易于清洗消毒、耐腐蝕、不起塵、不開裂、無反光、耐沖擊、光滑防水,防霉。地面要求防水處理,且地面整體向地漏處傾斜。地面材料應防滑、耐磨、耐腐蝕、無滲漏,踢腳不應突出墻面。潮濕地區的地面墊層應做防潮構造。斑馬魚養殖區地面承重荷載不小于650 kg/m2。地面設置地漏或排水溝,且應做防水處理。房門宜為防潮門,應有良好的密閉性和不透光。封閉斑馬魚養殖區域的窗戶,保證養殖區統一的光周期。應有防止昆蟲、鼠等動物進入的措施。斑馬魚養殖區安裝防潮,耐腐蝕實驗臺面。

2.3 斑馬魚魚房結構設計規劃

斑馬魚魚房的規劃設計與斑馬魚養殖系統有機整合,確保其正常運行及保證各項指標符合相關要求。如圖2所示,斑馬魚房規劃設計應包括外源斑馬魚檢疫隔離養殖區、斑馬魚內部養殖區、養殖系統電氣設施區(設備間)和顯微注射區等重要的功能區域。

2.4 外源斑馬魚檢疫隔離養殖區

斑馬魚魚房建設之初以及在日常運行過程中,需要從其它斑馬魚魚房引進斑馬魚魚種。這類外源的斑馬魚可能攜帶導致魚病的微生物或者病毒,對魚房內部養殖的斑馬魚健康造成安全隱患。因此,外源斑馬魚或者胚胎嚴格養殖在檢疫隔離區。外源斑馬魚繁殖的胚胎經消毒和病原菌檢測合格后[25],可以轉移至斑馬魚內部養殖區。檢疫隔離區在空間上完全與斑馬魚內部養殖區隔離。同時,隔離區內的斑馬魚養殖系統也嚴格與內部養殖區隔離,不共用養殖水和所有養殖用品,防止魚病擴散。

2.5 斑馬魚內部養殖區

斑馬魚內部養殖區用于斑馬魚的集中飼養及繁殖的區域,是魚房核心養殖區。該區域又可以細分為成年斑馬魚養殖區,斑馬魚幼魚養殖區和斑馬魚食物準備區。斑馬魚養殖架的放置間距不下于700 mm。配套有實驗臺面及大容積水槽。墻壁加裝置物架,便于存放養殖用品。房間要求溫度維持在26℃～29℃。室內照明自動化控制,且具有通風換氣系統。根據斑馬魚的生長特性,對于未性成熟(＜3個月)的斑馬魚幼魚,可以集中放置在內部養殖區統一區域養殖。豐年蟲是斑馬魚養殖中常用的餌料。一般以休眠卵的方式存儲。在使用前,需要在適宜的溫度(不低于28℃),爆氣和連續光照的條件下孵化,收集孵化的豐年蟲后,喂食斑馬魚。豐年蟲孵化器的遮光,避免自帶照明系統干擾斑馬魚內部養殖區的光周期。

2.6 養殖系統電氣設施區(設備間)

溫濕度對電氣自動化設備的影響大。高溫潮濕環境易導致設備受潮生銹,設備短路和跳閘等現象發生,嚴重的會使設備損壞,降低設備使用壽命[26]。斑馬魚養殖系統包括大量的電氣設備,均需要放置在干燥低溫的環境下。因此,養殖系統電氣設施區(設備間)要與斑馬魚養殖區物理隔離,避免養殖區恒溫潮濕影響電氣組件運行安全和壽命。設備間室溫不高于25℃為宜,便于大功率電氣組件散熱。另外,由于霉菌等在溫度25℃～30℃,環境濕度75%～95%的環境下,會大量滋生,造成絕緣材料的擊穿,霉菌會分泌一種酸性物質,能夠與絕緣材料發生化學反應,進一步降低設備的絕緣性能。設備間相對濕度不高于60%。可根據現場情況,加裝抽濕機和通風換氣系統。保證斑馬魚養殖系統的安全運行。

3 斑馬魚魚房室內配套工程

3.1 斑馬魚房溫控系統和通氣換氣系統

溫控系統的設計應充分考慮斑馬魚房所在地的自然氣候。能夠維持養殖區域溫度在25℃～29℃間。對于冬季氣溫過低的城市,可考慮安裝輔助加熱設施,例如燃氣取暖等,保證養殖區域溫度維持在25℃～29℃間。溫控系統的安裝便于日常的維修工作。宜自動控制功能和節能運行。其中,空調設備等具有抽濕功能。通氣換氣系統具除塵凈化、除濕(濕度不高于70%)功能。具有自動控制功能和節能運行。換氣效率10～15倍養殖區域體積/小時。通風換氣系統所鋪設的管道應防潮和耐腐蝕。斑馬魚檢疫隔離區域應安裝有獨立的溫控系統和通風換氣系統。

圖2 斑馬魚魚房建設平面規劃圖(中國國家斑馬魚資源中心魚房結構圖)Figure 2 Layout of zebrafish facility(Layout of China Zebrafish Resource Center)

3.2 給排水系統

3.2.1 給水

供水應符合國家標準GB 5749《生活飲用水衛生標準》的要求。給水管道,應選用不生銹、耐腐蝕和連接方便可靠的管材。管道外表面可能結露時,應采取有效的防結露措施。管徑DN25,供水量宜大于4 m3/h,水溫15℃～25℃,供水壓力大于0.1 Mpa,小于0.4 Mpa;接口設置閥門。斑馬魚檢疫隔離區域應獨立給水。

3.2.2 排水

凈水供水單元設備排水地漏DN80,最大排水量大于4 m3/h。循環單元排水地漏DN50,最大排水量大于2 m3/h。養殖單元排水地漏DN50,最大排水量大于2 m3/h。給水管道應選用不生銹、耐腐蝕和連接方便可靠的管材。斑馬魚檢疫隔離區域排水宜與建筑生活排水分開設置。排水管道應采用不易生銹、耐腐蝕的管材。

3.3 電氣

配電：斑馬魚魚房養殖區域用電負荷不宜低于2級,宜設置備用電源。總供電在配電時應考慮用電平衡,空調供電、水體循環單元設備供電、插座供電每一路供電安裝獨立的斷路器。斑馬魚養殖區所使用的開關、插座、空開和配電箱等設備的安全等級不低于IP65。設置專用配電柜,配電柜宜設置在通風干燥的房間。如供電電壓/電流不穩定,宜加裝穩壓設備。斑馬魚養殖區域設施的電氣管線應暗敷,設施內電氣管線的管口,應采取可靠的密封措施。配電管線宜采用金屬管,穿過墻和樓板的電線管應加套管,套管內應采用不收縮、不燃燒的材料密封。水體循環單元設備供電設380 V(±5%),50 Hz。三相五線制電源,線徑不小于10 mm2;安裝四極漏電保護斷路器,零線排、地線排。凈水供水單元設備供電設380 V(±5%),50 Hz。三相五線制電源,線徑不小于10 mm2;安裝四極漏電保護斷路器、地線排、零線排。獨立養殖單元供電220 V(±5%),50 Hz,10 A插座。食物培養器供電220 V(±5%),50 Hz 10 A插座。

3.4 照明

照明燈具應采用密閉潔凈燈,安全等級不低于IP65。斑馬魚養殖區照明系統可自動化控制,可定時開關獨立控制。安裝應急照明系統。

3.5 消防

新建斑馬魚魚房建筑的周邊宜設置環行消防車道,或必須沿建筑的兩個長邊設置消防車道?；A設施的耐火等級不應低于二級,或設置在不低于二級耐火等級的建筑中。斑馬魚房吊頂空間較大的區域,其頂棚裝修材料應為不燃材料且吊頂的耐火極限不應低于0.5 h。吊頂內可不設消防設施。應設置火災事故照明。疏散走道和疏散門均應設置燈光疏散指示標志。火災事故照明和疏散指示標志可采用蓄電池作備用電源,但連續供電時間不應少于20 min。宜設火災自動報警裝置。不應設置自動噴水滅火系統。斑馬魚養殖區宜配置對斑馬魚無毒和對養殖設備無損害的滅火設備。應設置消火栓系統且應保證兩個水槍的充實水柱同時到達任何部位。

4 結論與展望

綜上所述,在斑馬魚魚房建設之初,需要充分考慮斑馬魚養殖系統和基礎設施的特點。根據斑馬魚養殖系統的結構性能,合理規劃設計與之相配套的魚房結構和室內配套裝修工程,從而使斑馬魚系統與基礎設施有機整合。保證設施良性穩定運轉、為實驗用斑馬魚質量和實驗活動開展所需要的支撐保障條件。同時,斑馬魚魚房的標準化建設會將會促進斑馬魚實驗動物化的發展,推動斑馬魚科學研究的蓬勃發展。