一種改良的大鼠頸靜脈自主給藥插管及其應用

李貝貝張 歡陸思遠劉小珍王舒哲劉永濤邱云良*

(1.中國醫藥工業研究總院上海益諾思生物技術股份有限公司,上海 201203;2.上海工程技術大學化學化工學院,上海 201620;3.復旦大學藥學院,上海 201203;4.上海健康醫學院藥學院,上海 201318)

大鼠自主給藥實驗(rat self-administration)是建立大鼠成癮模型最常用的一種方法[1],也是臨床前依賴性評價中檢測新藥是否具有依賴性潛力的金標準[2-3]。大鼠自主給藥實驗通過頸靜脈插管手術,建立了將可獲得的藥物直接與頸靜脈相連通的靜脈注射模型,動物通過主動按壓踏板或者鼻觸,獲得從頸靜脈輸入的藥物,如若該藥物具有成癮性,則動物就會維持其踏板或者鼻觸行為,從而形成穩定的自主給藥行為,反映藥物的強化作用[4-5]。

自主給藥實驗時長都會長達幾周甚至數月之久,如若插管不在靜脈內或者發生堵管、漏液等問題,就導致藥物無法正常輸入靜脈,進而造成實驗的終止,所以頸靜脈插管手術是該實驗最基本也是最關鍵的技術,而插管設計的合理性直接決定了插管鼠的可用壽命?，F有用于自主給藥的插管產品主要分為兩種：一種為馬甲束縛式插管[6],另一種為無束縛式插管[7]。束縛式插管通過給大鼠穿戴馬甲的辦法固定體內插管,操作較為簡單,但插管破壞率較高,實驗成本也較高。無束縛式插管通過巧妙的多材料組合設計[8],將插管組件埋入動物背部皮下,解決了馬甲束縛式插管的缺點,但現有產品仍然存在著如下缺點[8-9]：生物相容性較差,容易造成傷口感染,且埋入動物皮下部分不能與皮下組織良好嵌合,對動物產生較大的異物感,影響動物情緒,進而影響自主給藥行為等缺點。

針對以上現有產品的特點,本文將提供一種改良的用于大鼠頸靜脈自主給藥實驗的插管設計,包括插管組件及其匹配的彈簧保護套管,本文將介紹其制作方法,并介紹利用此插管組件如何進行頸靜脈插管手術以及術后維護方法,并分析了本次實驗動物出現瀕死的原因及預防辦法,以期為利用自主給藥實驗進行各項科學研究的工作者提供一種更佳的頸靜脈插管方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

食物訓練成功的SPF級SD雄性大鼠29只,8～10周齡,體重251～296 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2019-0001]。動物單籠飼養于通風良好的SPF級動物實驗室[SYXK(滬)2019-0009],每12 h明暗交替(暗周期為7：00～19：00),飼養環境溫度控制在20℃～26℃,濕度控制在40%～70%。本實驗方案已經過上海益諾思生物技術股份有限公司實驗動物管理和使用倫理委員會(IACUC)批準(IACUC-2019-R-078),并按照3R原則給予動物人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

丙泊酚：四川國瑞藥業有限責任公司,批號：1607292、1811161、1812202、1811153;可卡因：青海制藥廠有限公司,批號：20160401;肝素：江蘇萬邦生化醫藥集團有限責任公司,批號：51711111。MED大鼠自主給藥系統：購自美國Med Associates公司,型號MED-008-CT-01;全自動血液分析儀：購自美國西門子公司,型號ADVIA 2120;全自動生化分析儀：購自日本HITACHI,型號7180。

1.3 實驗方法

1.3.1 插管組件制作

(1)制作材料

如圖1所示a圖,制作材料有：硅膠管(內徑0.5 mm,外徑0.9 mm)、23G不銹鋼導管(長度24 mm)、M4螺紋尼龍固定底座(包含一個垂直的螺柱和一個水平的具有側方開口的圓形底座)、圓形聚丙烯墊片(直徑25 mm)、一端封閉的硅膠帽(長約5 mm,內徑0.5 mm,外徑2 mm)、M4螺紋尼龍帽(內螺紋與M4螺紋尼龍固定底座匹配)、二甲苯、生物相容性良好的瞬干膠Apollo 2240及其催化劑。

(2)制作流程

1)將不銹鋼導管小心套入長硅膠管(長約13 cm)中,大約套至不銹鋼導管的一半處,然后將兩個長約2 mm硅膠結點用鑷子輔助套入長硅膠管遠離不銹鋼導管端的3.5 cm處和5.5 cm處,分別稱作第一結點和第二結點;然后用二甲苯將短硅膠管(長約3 cm)浸泡幾分鐘,待管子膨脹后將其套入不銹鋼導管,將不銹鋼導管上的長硅膠管覆蓋,起到了保護和加固長硅膠管的作用;待二甲苯揮發完全后,用鑷子將不銹鋼導管一端0.5 mm處彎折90°彎折的時候一定要輕柔,防止導管損壞。將該組合稱為組合A。

2)將組合A的不銹鋼導管插入固定底座中,不銹鋼導管彎折端位于其側方開口處,而露出螺柱的不銹鋼導管約為5 mm。將該組合稱為組合B。

3)將組合B的水平底座部分與聚丙烯墊片的中央位置用瞬干膠粘合,同時涂布少量瞬干膠于將要埋植于皮下的部分(因該固定底座無生物相容性,故用膠水覆蓋降低動物不適度),并用瞬干膠催化劑加速固化,放置至少24 h后,套上具有保護作用的硅膠帽和尼龍帽,紫外消毒后,便得到了插管組件,如圖1所示b圖。

1.3.2 彈簧保護套管制作流程

(1)材料準備

保護彈簧：長305 mm,外徑3 mm,內徑2 mm,用以保護內部輸液導管不被動物破壞;可拆卸的雙通道軸承接口;輸液導管：長350 mm,內徑0.35 mm,外徑0.8 mm的硅膠管;M4螺紋尼龍帽(與插管組件中的尼龍帽規格一致);熱熔膠。如圖1所示c圖。

(2)制作流程

將保護彈簧一端的外圍涂布少量熱熔膠,然后將尼龍帽的一端套在熱熔膠上,使尼龍帽與保護彈簧重疊長度約5 mm,待其固化后,將軸承接口的其中一個孔道與保護彈簧的另一端(遠離尼龍帽端)對接固定,然后將輸液導管穿引到保護彈簧中即得彈簧保護套管,將該彈簧保護套管與自主給藥實驗箱的平衡臂連接即得輸液系統,如圖1所示d圖,輸液系統與注射泵連接。當給藥時,將插管組件的尼龍帽和硅膠帽去除,與彈簧保護套管上的輸液導管和尼龍帽連接即可給藥。

1.3.3 頸靜脈插管手術

(1)術前準備

無菌手術器械包括但不限于止血鉗、持針鉗、眼科鑷、大剪刀、眼科剪、顯微剪、顯微鑷、墊片,上述制作好的插管組件(于慶大霉素稀釋液中浸泡至少10 min)、不可吸收無菌縫合線和縫合針、25 IU/mL濃度的肝素鈉、生理鹽水、75%酒精、平頭注射器、麻醉藥(如3%戊巴比妥鈉)、鎮痛藥(如痛立定)、抗生素(如青霉素)、潤眼劑(如金霉素眼膏)等。

(2)手術步驟

采用合適鎮痛藥和麻醉藥對動物進行麻醉后涂抹潤眼劑,剔除動物背部和右側頸部被毛背臥位固定(見圖2a);切口部位消毒后,于大鼠右側頸部剪一約1 cm縱口(末端靠近鎖骨中線),用止血鉗鈍性分離皮下組織暴露頸靜脈,用縫合線結扎遠心端(見圖2b);在肩胛骨中心橫向切一小切口約0.5 cm,再在遠離肩胛骨中心2 cm處縱向下行切一大切口約2 cm,插管組件的底座部分將固定于肩胛骨中心部位,故將肩胛骨皮下部位分離出足夠的空間;將插管組件的導管從大切口導出到頸部切口后,將插管組件的底座部分從大切口移至小切口,固定底座的螺柱從皮下小切口拉出,墊片則平整植于皮下(見圖2c);在不銹鋼導管端外接一段無菌硅膠管,然后再連接含有生理鹽水的平頭注射器,使整個插管組件的硅膠管都注滿生理鹽水,并排除氣泡;用顯微剪在分離的頸靜脈上橫向切一個小口,在顯微鑷輔助下將導管插入頸靜脈血管至第一結點處后,用縫合線將第一結點前后兩邊各與血管結扎,而第二結點前后兩邊各與皮下肌肉進行結扎,每次結扎后用平頭注射器回抽血液,以檢查插管成功與否(見圖2d);確定插管成功后,用慶大霉素稀釋液將所有切口沖洗后縫合(見圖2e),通過插管給予約4萬單位的青霉素預防感染,再給予約0.2 mL肝素鈉后蓋上硅膠帽和尼龍帽(見圖2f)。

(3)術后護理

術后大鼠單籠飼養,密切觀察動物身體狀況,至少連續3 d通過插管給予青霉素預防感染。手術后第2天開始到整個實驗結束,每天用肝素鈉(推薦濃度25 IU/mL)進行插管維護。手術后到整個實驗結束期間,用合適的麻醉藥進行插管性能測試,本實驗所用的麻醉藥為丙泊酚(測試劑量為3 mg/kg),每周測試1次,若給予適量麻醉藥后動物能迅速出現麻醉癥狀,表明插管狀態良好,否則表明插管可能不在靜脈內或有漏液可能。

1.3.4 自主給藥模型建立

圖1 插管組件及其的彈簧保護套管分解圖和整體圖Note.A,Exploded view of intubation combination.b,Overall view of intubation combination.c,Exploded view of spring protection sleeve.d,Overall view of spring protection sleeve.Figure 1 Exploded view and overall view of intubation combination and its spring protection sleeve

圖2 頸靜脈插管手術步驟圖示Figure 2 Illustration of jugular vein intubation surgery

術后恢復至少7 d,采用MED大鼠自主給藥實驗箱建立自主給藥模型,首先建立維持劑量下固定比率(fixed ratio,FR)為3的丙泊酚自主給藥模型,參考相關文獻[10-12],丙泊酚維持劑量選擇為1.7 mg/(kg·injection),表示每次注射劑量為1.7 mg/kg,每天2 h,確認建模成功后(連續3 d注射次數變異率不超過20%),替換劑量分別為0(生理鹽水)、0.1、0.5、1.0、1.7、3.0 mg/(kg·injection)的丙泊酚,每個劑量連續替換3 d,測試自身給予丙泊酚的劑量-注射次數關系。而后繼續用該批動物建立可卡因維持劑量下FR為10的可卡因自主給藥模型,參考相關文獻[13-15],可卡因維持劑量選擇為0.56 mg/(kg·injection),每天1 h,確認建模成功后(連續3 h注射次數變異率不超過20%),替換劑量分別為0(生理鹽水)、0.05、0.1、0.18、0.32、0.56、1.0 mg/(kg·injection)的可卡因,每個劑量連續替換3 d,測試自身給予可卡因的劑量-注射次數關系。除給藥期間動物置于實驗箱外,其余時間動物于飼養籠中飼養,分析術后5個月的動物淘汰情況。自主給藥實驗方法詳細內容可參見Markgraf等[16]的文獻報道,本文不做贅述。

1.3.5 動物瀕死探究

術后第36天由于兩只動物瀕死,分別稱為1號瀕死動物和2號瀕死動物,對兩只瀕死動物進行大體解剖、血液學檢測和血清生化檢測,以探究動物瀕死原因;為探究動物瀕死率降低方法,于術后第43天、第50天、第57天分別對所有存活動物進行血液學檢測并進行及時的抗生素治療。

2 結果

2.1 自主給藥模型建立結果

分別有9只動物和8只動物成功完成了所有測試劑量下的丙泊酚自主給藥模型和可卡因自主給藥模型的建立,如圖3和圖4所示,橫坐標代表丙泊酚或可卡因給藥劑量,縱坐標代表平均注射次數,每個劑量下的3個條形圖代表連續替換3 d的平均注射次數(平均數±標準差),可以看出在各自維持劑量下均形成了穩定的自主給藥行為,并得到了比較經典的“倒U”型劑量-注射次數關系。兩個陽性藥自主給藥模型建立的成功說明本文所設計的插管組件應用于自主給藥模型建立效果良好,能夠滿足自主給藥實驗的基本需求,適用于大鼠自主給藥相關研究。

2.2 術后動物淘汰數量情況

由表1可知,術后動物淘汰原因主要有瀕死、堵管、漏液及其他。術后第1個月,2只動物漏液,藥液未能完全打入頸靜脈,從背部傷口溢出,可能是導管脫落,也可能是導管接口處破損導致的漏液;術后第2個月,2只動物堵管,4只動物因細菌感染瀕死;術后第3個月,1只動物漏液,1只動物堵管,3只動物系因自主給藥實驗進度需要予以淘汰,與插管無關;術后第4個月,2只動物因細菌感染瀕死,5只動物堵管;術后第5個月,1只動物因細菌感染瀕死。

圖3 丙泊酚劑量-注射次數關系圖(±s,n=9)Figure 3 Diagram of propofol dose-injection relationship

與插管相關的直接淘汰原因為堵管和漏液,術后第1至5個月每個月與插管直接相關的淘汰率分別為7%、7%、10%、31%和11%,術后第4個月,動物發生堵管的數量相對較多,達到5/16例。如圖5術后堵管/漏液時間線,可以看出從術后第4個月開始淘汰集中,在月淘汰率在10%以內尚能接受的情況下,該插管組件的使用壽命預計至少3個月,部分插管使用壽命能夠長達5個月甚至可能5個月以上。

2.3 動物瀕死原因分析

2.3.1 瀕死原因分析

術后第36天日,兩只動物瀕死,分別稱為1號瀕死動物和2號瀕死動物,瀕死癥狀均表現為呼吸急促、活動減少、攝食減少,其中1號比2號瀕死癥狀嚴重,于發現當天進行了大體解剖、血液學檢測和血清生化檢測,結果如下：

1號瀕死動物：大體解剖結果顯示為動物脾略大、胸腺膠凍樣、肝見多個淡黃色斑點、回腸散見出血點、膀胱見紅色液體、胸腔嚴重積液。血液學檢測結果顯示白細胞總數(37.86×109/L)顯著增多,以中性粒細胞(21.46×109/L)增多為主,表明1號瀕死動物體內有嚴重炎癥反應,進而造成胸腔積液,血小板(199×109/L)減少,進而造成了回腸和膀胱的出血。血清生化檢測結果顯示丙氨酸氨基轉移酶(1494 U/L)活性增高、天門冬氨酸氨基轉移酶(1074 U/L)活性增高、堿性磷酸酶(539 U/L)活性增高、總蛋白(46 g/L)減少、白蛋白(22 g/L)減少,表明肝嚴重損傷;尿素氮濃度(36.30 mmol/L)升高、肌酐濃度(82 mmol/L)升高,表明腎嚴重損傷;鈉濃度(134.1 mmol/L)降低、鉀濃度(7.76 mmol/L)升高、氯濃度(90.4 mmol/L)降低,表明電解質紊亂。綜上表明1號瀕死動物由于體內嚴重的炎癥反應進而造成了肝腎的嚴重損傷及電解質紊亂。

圖4 可卡因劑量-注射次數關系圖(±s,n=8)Figure 4 Diagram of cocaine dose-injection relationship

2號瀕死動物：大體解剖結果顯示為動物脾略大、胸腺膠凍樣、肝見一尺寸為0.5 cm×0.5 cm的暗紅色斑塊,胸腔嚴重積液。血液學檢測結果顯示白細胞總數(15.82×109/L)也顯著增多,以中性粒細胞(8.44×109/L)增多為主,表明2號瀕死動物體內也有炎癥反應,進而造成胸腔積液,血小板(217×109/L)減少,進而可能造成了肝出現暗紅色斑塊。血清生化檢測結果顯示2號瀕死動物血清生化指標未見明顯異常。綜上表明2號瀕死動物的瀕死癥狀是由于體內的炎癥反應造成的,還暫未造成肝腎嚴重損傷和電解質紊亂。

以上結果表明,該兩只動物瀕死的原因與肝腎嚴重損傷、電解質紊亂和體內炎癥有關,推測是細菌感染造成的炎癥,后續動物出現瀕死的癥狀與該兩只動物瀕死癥狀相同,推測與自主給藥實驗長期頸靜脈置管本身存在的缺點有關,實驗箱中的輸液系統、每日通管所用材料、所給藥液、飼養籠中的糞便尿液、暴露于外部的不銹鋼導管等,均不可避免帶有致病菌,逐漸地,便會導致個體免疫能力較弱的動物免疫系統的崩潰,影響動物的身體狀況,進而影響實驗結果。

2.3.2 降低動物瀕死率分析

術后第36天兩只動物因細菌感染出現瀕死后,表明此時大部分動物處于高危感染狀態,為降低動物瀕死率,及時于第38天開始予以所有動物青霉素抗感染治療(劑量每只約4萬單位,每天1次)。于術后第43天進行血液學檢測,此時已進行了連續6 d的青霉素治療,大部分動物雖無明顯感染癥狀,但血液學顯示大部分動物白細胞顯著增多,表明致病菌對青霉素不敏感,故于第44天開始更換為頭孢曲松抗感染治療(劑量約每只0.05 g,每天兩次)。為檢測抗感染效果,于第50天、第57天分別進行血液學檢測,三次檢測結果見表2。

表2僅列出了最能代表動物細菌感染狀況的兩個指標,即白細胞總數(WBC)和中性粒細胞百分數(%NEUT),結果表明更換為頭孢曲松后,WBC和%NEUT逐漸降低且接近參考值,術后第57天血液學檢測表明大部分動物指標都恢復正常,個別指標偏高動物繼續予以頭孢曲松治療,為了降低后續實驗進程中瀕死概率,約每兩周進行1次連續3～5 d療程的頭孢曲松預防治療。圖6術后瀕死時間線可以看出后續實驗過程中動物出現瀕死概率降低,表明頭孢曲松抗感染卓有成效。

表1 術后動物淘汰數量情況Table 1 Number of animals eliminated after surgery

圖5 術后堵管/漏液時間線Note.D,The day after surgery.Figure 5 Timeline of occlusion/leakage after surgery

表2 血液學檢測結果(±s,n=21)Table 2 Results of hematology test

表2 血液學檢測結果(±s,n=21)Table 2 Results of hematology test

注：D：術后第幾天。Note.D,The day after surgery.

檢測階段D e t e c t i o n p h a s e W B C(1 0 3 c e l l s/μ L) %N E U T(%)術后 D 4 3 P o s t o p e r a t i v e D 4 3 1 7.0 6±5.7 0 3 3.0 2±1 6.9 8術后 D 5 0 P o s t o p e r a t i v e D 5 0 1 2.8 4±2.9 7 2 5.6 6±1 0.0 1術后 D 5 7 P o s t o p e r a t i v e D 5 7 1 0.3 2±3.5 5 2 0.4 0±7.7 9

圖6 術后瀕死時間線Note.D,The day after surgery.Figure 6 Dying timeline after surgery

3 討論

本文插管組件和彈簧保護套管設計改良點及優點如下：1)現有技術中采用的粘合材料為牙托材料,本設計采用了符合生物相容性標準的醫療級瞬干膠Apollo 2240配合催化劑作為粘合材料,10 s內即可固化,制作速度快,僅涂布底座面積大小便可得到極佳的固定效果,更無刺鼻氣味產生,極大程度上降低了動物所感受到的異物感,縮短了手術恢復期,緩解了動物情緒,降低了實驗影響因素。2)現有技術中的墊片為滌綸材料,本設計采用的是聚丙烯材料的疝修補補片,是目前臨床上首選的腹壁缺損的修補材料,這種材料經研究證實其具有優良的生物相容性[17],能夠刺激纖維組織增生進而快速與組織嵌合[18],加快了傷口恢復,并起到了加固作用,降低了插管脫落的可能性,其次由于其網孔較大,不易隱藏細菌,有抗菌功能,更耐受感染[19]。3)現有技術中插管上為兩個不可移動的硅膠球,而本設計為兩個可移動的硅膠結點,可以根據動物大小調節結點位置,其中第一結點定位在頸靜脈切口處,在第一結點左右兩邊各與血管結扎,而第二結點左右兩邊各與皮下肌肉進行結扎,能有效防止導管脫落。4)現有技術僅采用單通螺紋尼龍帽,本設計采用硅膠帽和M4螺紋尼龍帽,比現有技術更能保證插管的清潔[8],降低全身感染率。每日進行肝素通管維護時,只需將尼龍帽和硅膠帽卸下,通管完畢放回飼養籠時再將其裝上即可。5)與現有技術相比,本設計通過尼龍帽巧妙地將插管組件與彈簧保護套管相匹配,將輸液導管套在插管組件外露的不銹鋼導管上,然后將彈簧保護套管的尼龍帽擰接在插管組件上即可給藥,由于是螺紋設計,連接非常牢固,且不易被動物破壞,降低了輸液導管的破壞率。

在本次實驗中,術后第36天開始出現瀕死現象,提示我們在長期頸靜脈置管給藥難以保證完全無菌的情況下,除了使體外各管道通路采取有效辦法滅菌外[20],還可采用定期給予抗生素預防的辦法以降低瀕死率,并同時需要考慮細菌耐藥性的產生,更換不同的抗生素。根據本次實驗的結果,提示我們如果自主給藥周期超過約1個月,就需要密切關注動物的身體狀況,在不影響實驗目的的情況下,可以采用定期進行血液學檢測以及定期進行抗生素預防治療的辦法,以防止由于動物身體狀況不佳而造成實驗終止的發生。

本文所設計插管組件的插管鼠最佳使用壽命可長達3個月,能夠滿足自主給藥實驗的基本需求,應用效果良好,可以推廣使用。該插管組件設計除了可以應用于大鼠自主給藥成癮性研究和非臨床新藥依賴性評價外,還可以應用于需要長期采血的大鼠藥物代謝研究,也可應用于靜脈途徑給藥周期較長的長期毒性試驗。