經皮迷走神經耳支刺激改善心力衰竭犬的心功能研究

趙利 蘇瑋 王坤

摘要：目的 ?探討低強度經皮迷走神經耳支刺激（AB-VNS）治療對心衰犬心功能改善情況的影響。方法 ?24只Beagle犬均植入起搏器，分成假手術組（n=8），心衰組（n=8），AB-VNS組（n=8）。假手術組僅植入起搏器但不起博;心衰組和AB-VNS組行起搏器起搏制作心衰模型，AB-VNS組給予低強度經皮耳迷走神經刺激治療8周。心臟超聲測量射血分數（EF）和左室舒張末期直徑（LVEDD）;酶聯免疫吸附法測定血清NT-proBNP、CRP和TNF-α濃度;電生理方法檢測心率、ERP;取心肌組織做Masson染色觀察心肌組織形態學改變。結果 ?經皮耳迷走神經刺激治療8周后AB-VNS組的EF[（53.50±2.59）%]高于心衰組[（45.17±3.06）%]，LVEDD[（37.17±1.60）mm]小于心衰組[（53.83±6.15）mm]，差異有統計學意義（P<0.05）;AB-VNS組Nt-proBNP低于心衰組[（388.56±40.94）pg/ml vs （674.91±56.78）pg/ml]、CRP[（9.57±1.18）mg/L vs （9.57±1.18）mg/L]、TNF-α[（6.40±0.63）ng/L vs （10.82±0.88）ng/L]、靜息心率[（124.17±7.30）bpm vs（146.67±8.14）bpm]，ERP較心衰組延長[（158.50±5.24）ms vs（125.17±4.83）ms]，差異有統計學意義（P<0.05）。AB-VNS組Masson染色示心肌細胞形態較規則，伴有少量膠原纖維。結論 ?低強度經皮迷走神經耳支刺激有助于提高心衰犬心射血分數、降低NT-proBNP和炎癥因子，并減慢心率、延長有效不應期。

關鍵詞：心力衰竭;迷走神經耳支;心功能;心衰犬

中圖分類號：R541.6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.018

文章編號：1006-1959（2020）11-0058-04

Abstract：Objective ?To investigate the effect of low-intensity percutaneous vagal nerve branch stimulation （AB-VNS） on the improvement of heart function in dogs with heart failure.Methods ?All 24 Beagle dogs were implanted with pacemakers and divided into sham operation group （n=8）， heart failure group （n=8）， AB-VNS group （n=8）. In the sham-operated group， only a pacemaker was implanted， but it was not worthwhile; the heart failure group and the AB-VNS group were paced to make a heart failure model， and the AB-VNS group was given low-intensity percutaneous ear vagus nerve stimulation treatment for 8 weeks. Cardiac ultrasound measures ejection fraction （EF） and left ventricular end-diastolic diameter （LVEDD）; enzyme-linked immunosorbent assay to determine serum NT-proBNP， CRP and TNF-α concentration; electrophysiological methods to detect heart rate， ERP; take myocardial tissue for Masson staining was used to observe the morphological changes of myocardium.Results ?After 8 weeks of percutaneous ear vagus nerve stimulation treatment， the EF [（53.50±2.59）%] in the AB-VNS group was higher than the heart failure group [（45.17±3.06）%]， and the LVEDD [（37.17±1.60） mm] was smaller than the heart failure group [（53.83±6.15）mm]， the difference was statistically significant （P<0.05）; AB-VNS group Nt-proBNP was lower than heart failure group [（388.56±40.94） pg/ml vs （674.91±56.78） pg/ml]， CRP [（9.57±1.18） mg/L vs （9.57±1.18） mg/L]， TNF-α [（6.40±0.63） ng/L vs （10.82±0.88）ng/L]， resting heart rate [（124.17±7.30） bpm vs （146.67±8.14） bpm]， ERP was longer than heart failure group [（158.50±5.24） ms vs （125.17±4.83） ms]， the difference was statistically significant （P<0.05）. Masson staining in AB-VNS group showed that the shape of myocardial cells was regular， with a small amount of collagen fibers.Conclusion ?Low-intensity percutaneous vagus nerve branch stimulation can help increase heart ejection fraction， reduce NT-proBNP and inflammatory factors， and slow heart rate and prolong the effective refractory period in dogs with heart failure.

Key words：Heart failure;Vagus nerve ear branch;Heart function;Heart failure dog

心力衰竭（heart failure）簡稱心衰，是各種心臟疾病的共同終末結局，也是最主要的死亡原因，目前已成為嚴重威脅人類健康的一大類疾病。調節自主神經失衡的狀態，可以改善心衰的癥狀，干預自主神經成為心衰治療的研究方向。通過增強迷走神經活性，與交感神經建立新的平衡狀態，可作為心衰治療的手段之一。本研究運用起搏器起搏制作Beagle犬心衰模型，給予經皮迷走神經耳支刺激（auricular branch of the vagus nerve stimulation，AB-VNS）8周，分析低強度迷走神經刺激改善心衰犬的心功能情況，現報道如下。

1對象與方法

1.1研究對象 ?健康Beagle犬（8～12周齡），體重（12.21±2.66）kg，雌雄不拘。實驗設計及實施均經過新醫大一附院動物倫理委員會審核批準。根據隨機數字表法將實驗犬分為3組，假手術組（n=8），心衰組（n=8），AB-VNS組（n=8）。由有經驗的專業人士定時喂養。

1.2持續快速起搏右心室致心衰犬模型的建立 ?本實驗采用物理埋藏式高頻起搏器起搏（250次/min）右心室誘發犬心衰，用低頻維持心衰（190次/min）、10周后建立充血性心衰模型。行微創開胸術，均植入起搏器。假手術組：植入起搏器但不起博;心衰組和AB-VNS組植入起搏器并起搏制作心衰模型。心衰模型成功后，心衰組不予以經皮迷走神經耳支刺激，AB-VNS組給予低強度經皮耳迷走神經刺激8周。

1.3經皮迷走神經耳支刺激心衰犬 ?本實驗用遠程控制系統監測犬的血壓、心率。左/右耳屏用2個鱷魚夾每隔1 d給予2 h電刺激，每次一側刺激 ? ? ? ?2 min，間隔2 min，刺激對側，左/右側交替刺激，共8周，刺激強度為80%的閾值電壓（刺激頻率20 Hz、低強度電壓0.5～1 V，脈寬1 ms）。刺激的電壓閾值是達到竇房傳導速度減慢20%以上的最低電壓。在刺激過程中用Lead7000記錄體表心電圖。

1.4心電圖記錄及心室刺激 ?將多極電極縫合到心室的自由壁以給出程序化的心室刺激，并通過LEAD 7000（Lead 7000，Jinjiang Electronics，China）記錄體表ECG。進行程序化刺激以確定心室有效不應期（Ventricular Effective refractory period，VERP），并將ERP定義為未能做出反應的最長S1-S2間期。基礎心臟周長S1S1為300 ms，刺激率比為8∶1，步長為-10 ms。測量了3次后取平均為最終的ERP。

1.5超聲心動圖檢查心臟形態和功能 ?在動物清醒狀態下行超聲心動圖檢查，在二維超聲引導下用M超聲進行心臟功能和大小的測量，所得到的計量資料連續測量3個心動周期后取其平均值。測量左室舒張末內徑（LVEDD）和左室射血分數（EF），EF≤50%作為判斷心衰發生的指標。

1.6 Masson染色觀察犬心室肌病理改變 ?各實驗組犬左心室組織（1 mm×3 mm～1 mm×5 mm）用10%福爾馬林固定，經過石蠟包埋切片：①石蠟切片脫蠟至水，自來水和蒸餾依次水洗;②將切片用Regaud蘇木精染液染核5～10 min;③將切片充分水洗，若過染可鹽酸酒精分化，酒精分化后再蒸餾水水洗;④先將切片用Masson 麗春紅酸性復紅液室溫下泡5～ 10 min;⑤將切片用2%冰醋酸水溶液浸洗幾秒鐘，然后用1%磷鉬酸水溶液分化3～5 min;⑥將切片直接用苯胺藍5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗幾秒鐘;⑦用95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠等材料封固。取玻片覆蓋，顯微鏡下觀察組織像。

1.7血清學指標測定 ?采集腹壁靜脈或者耳靜脈血約5 ml， 室溫靜置30 min，3000 r/min離心10 min，將血清分裝于EP管中，于-80 ℃冷凍保存，通過酶聯免疫吸附法測定N末端腦鈉肽前體（N-Terminal pro-Brain Natriuretic Peptide、Nt-proBNP）、C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。

1.8統計學處理 ?應用統計學軟件SPSS 25.0處理實驗數據。計量資料以（x±s）差表示，組內比較采用配對資料的t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以（n）表示。P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1三組Beagle犬心臟超聲結果分析比較 ?心衰組EF基線水平及8周后水平均低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）;心衰組LVEDD基線水平及8周后水平均高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）; 8周后，AB-VNS組的EF高于心衰組，差異有統計學意義（P<0.05）;AB-VNS組的LVEDD小于心衰組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2三組Beagle犬血清學指標結果比較 ?心衰組基線水平和8周后的Nt-proBNP、CRP和TNF-α均高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）。治療8周AB-VNS組Nt-proBNP、CRP、TNF-α均低于心衰組，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3三組Beagle犬基線水平和8周后心率和ERP結果比較 ?心衰組基線水平和8周后靜息心率均高于假手術組，心衰組基線水平和8周后ERP均低于假手術組，差異有統計學意義（P<0.05）。8周后AB-VNS組的靜息心率低于心衰組、ERP高于心衰組，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。