野菊花中總黃酮的含量測定及提取工藝優(yōu)化

李夢瑤，王維禮，杜妍

（吉林省吉林市食品藥品檢驗所，吉林 吉林 132000）

0 引言

響應曲面法（Response surface methodology，RSM）是一種研究實驗結(jié)果與多個實驗因子之間關系的試驗設計[1]。通過擬合因素與響應值形成的函數(shù)關系來篩選最佳提取工藝，因其可以深入了解實驗因子間的交互作用，彌補了傳統(tǒng)單因子變量優(yōu)化工藝實驗的不足，近年來得到廣泛應用。本實驗主要通過響應曲面法優(yōu)選野菊花中的總黃酮，再利用紫外可見分光光度法對其含量進行測定。隨著科學技術的發(fā)展與普及，采用先進的科學方法對傳統(tǒng)中藥進行深入研究是目前最好的傳承方式，而研究中藥的提取工藝、分離純化技術等更是中藥現(xiàn)代化的基礎組成部分[2]。野菊花存在的歷史悠久，對其深入研究開發(fā)并加以利用，可以為推進中藥現(xiàn)代化的進程增添助力。

1 實驗方法

1.1 標準曲線的制備。精密稱取蘆丁標準品5 mg，用60%乙醇溶液將其定容于25 mL 容量瓶中，則蘆丁標準品溶液濃度為0.2 mg/mL。分別吸取0 mL，1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL 的標準品溶液置于10 mL 容量中，依次向其中加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，4%氫氧化鈉溶液3 mL，搖勻后靜置15 min，用60%乙醇定容至刻度。在510 nm 處測吸光度值A，以蘆丁標準品溶液濃度為橫坐標，吸光度值A 為縱坐標作標準曲線和線性回歸方程Y=10.346X+0.00979(R2=0.99889)。

1.2 供試品溶液的制備。精密稱取1.25 g 干燥后的菊花粉末，按實驗設計下的條件進行提取和過濾，將濾液定容于100 mL容量瓶中，靜置待測。

1.3 黃酮含量的測定。從上述待測液中吸取1 mL 試液加于10 mL 容量瓶中，依次向其中加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，4%氫氧化鈉溶液3 mL，搖勻后靜置15 min，用乙醇定容至刻度，在510 nm 處測吸光度A 值。利用標準曲線測得供試品總黃酮濃度，通過計算求得供試品總黃酮含量。

1.4 單因素試驗設計。為了選取最優(yōu)的提取條件，本文考察乙醇濃度、提取溫度、提取時間及提取次數(shù)四個單因素對總黃酮提取率的影響。

1.5 中心組合設計。為了進一步分析各單因素之間的深入交互作用對提取率造成的影響，在確定單因素水平的基礎上，利用Design-Expert 軟件中的Box-Behnke 中心組合設計原理，以總黃酮含量為響應值，確定各因素的影響能力，見表1。

表1 中心組合因素水平

1.6 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響。精密稱取1.25 g 干燥后的菊花粉末，分別以濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，在提取溫度為50℃，提取次數(shù)為1 次，提取時間為30 min 的條件下進行試驗，測得吸光度值A，并計算提取率。 由計算結(jié)果可知，單因素乙醇濃度的最適濃度為60%，因此中心組合設計將考察范圍確定為50%-70%。

1.7 提取溫度對總黃酮提取率的影響。精密稱取1.25 g 干燥后的菊花粉末，分別以提取溫度為50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，在乙醇濃度為60%，提取次數(shù)為1 次，提取時間為30 min 的條件下，進行試驗，測得吸光度值A，并計算提取率。由計算可知，單因素提取溫度的最適條件為70℃，因此中心組合設計將考察范圍確定為60℃-80℃。

1.8 提取時間對總黃酮提取率的影響。精密稱取1.25 g 干燥后的菊花粉末，分別以提取時間為30 min、45 min、60 min、75 min、90 min，在乙醇濃度為60%，提取溫度為70℃，提取次數(shù)為1 次的條件下，進行試驗，測得吸光度值A，并計算提取率。由計算可知，單因素提取時間的最適條件為60 min，因此中心組合設計將考察范圍確定為30-90 min。

1.9 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響。精密稱取1.25 g 干燥后的菊花粉末，在乙醇濃度為60%，提取時間為60 min，提取溫度為70℃的條件下進行試驗，發(fā)現(xiàn)在提取四次時的提取率比提取三次的提取率明顯降低。由計算可知，單因素提取次數(shù)的最適條件為3 次，因此中心組合設計將考察范圍確定為2-4 次。

2 結(jié)果分析

通過Design Expert 將隨機的29 組試驗分析得到對應方差分析表、標準偏差表、響應曲面圖以及回歸方程。最終通過設計得到最優(yōu)提取工藝。

通過總黃酮含量的響應值R 作為依據(jù)，各因子作為參數(shù)得到擬合的回歸方程：R=50.32+1.33A-1.44B-1.22C-1.09D+2.69AB-1.18AC+1.78AD+0.54BC-1.37BD+0.39CD-2.91A2-1.01B2-0.67C2-2.38D2 ，其中R2=0.8264。在方差分析表中，模型的P 值小于0.05 而失擬的P 值大于0.05，證明該模型顯著性較好。失擬值F 項數(shù)據(jù)較小，證明模型擬合度高，誤差小，可信度高，可以應用該模型進行試驗分析。在擬合方程中，比較各因素前的系數(shù)，可知各因素影響能力的大小及交互作用時的影響能力。對于兩種因素交互影響的結(jié)果，可以通過給出的響應曲面進行更直觀的參考，即以響應值作為參考依據(jù)，通過呈現(xiàn)的立體三維圖得到兩個因素交互影響后的試驗結(jié)果。

表2 試驗優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)實驗最終的優(yōu)化結(jié)果（見表2），可知實際操作中野菊花中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度60%，提取溫度60℃，提取時間30 min，提取次數(shù)3 次。

3 討論

本文通過對影響野菊花中總黃酮提取因素的研究，發(fā)現(xiàn)對其影響能力由大到小依次是提取溫度、乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)，由于試驗中限制于此四個單因素，且Design Expert 中的Box-Behnke 中心組合設計限定于三個水平，因此在一定范圍內(nèi)，可以將最終優(yōu)化條件確定為乙醇濃度60%，提取溫度60℃，提取時間30 min，提取次數(shù)3 次。

野菊花為菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥頭狀花序，是中國傳統(tǒng)常用中藥材之一，常在秋、冬二季花初開放時采摘，曬干，或蒸后曬干入藥。其味苦、辛，性微寒。歸肝、心經(jīng)。具有清熱解毒，瀉火平肝的功效。主要用于疔瘡癰腫，目赤腫痛，頭痛眩暈[3]。具有抗病原微生物、降血壓、保護心腦血管系統(tǒng)、抗氧化等多種藥理作用[4-5]。

在實際生產(chǎn)生活中，影響中藥材有效成分的因素有許多，包括品種、生長環(huán)境、栽培條件、采收、產(chǎn)地加工等，而這些將直接影響藥材的最終質(zhì)量[6]。為將我國傳統(tǒng)中藥繼續(xù)傳承與弘揚，在保證源頭質(zhì)量的情況下，優(yōu)選各中藥成分復雜的提取條件已成為重中之重。