白藜蘆醇清除DPPH自由基反應(yīng)的動力學(xué)

周巾英，歐陽玲花，王麗，祝水蘭，潘潤天，馮健雄*

江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（南昌 330200）

自由基造成了一些疾病如動脈粥樣化、神經(jīng)變性、慢性抑郁癥、癌癥和生理學(xué)衰老等[1-2]而引起人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)抗氧化劑具有清除自由基能力，具有抗病、抗菌、抗逆及延緩衰老等作用[3]，已被廣泛用于食品工業(yè)中。抗氧化劑分為合成抗氧化劑和天然抗氧化劑，合成抗氧化劑因?qū)θ梭w健康存在一定的危害，許多國家已禁用有些合成抗氧化劑[4]。天然抗氧化劑在自然界廣泛存在，種類繁多，有很大的潛力取代合成抗氧化劑，也是今后食品工業(yè)的發(fā)展趨勢。因此，從天然植物中尋找高效、安全的天然抗氧化劑，及研究各種天然抗氧化成分的作用機理，都是值得深入研究的課題。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種生物活性很強的天然多酚類化合物，具有抗衰老[5]、降低血小板聚集[6]、預(yù)防和治療心血腦管疾病[7]、抗菌[8]、抗致癌作用[9]，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[10]。大量研究報道是致力于從葡萄、虎杖、花生等植物中提取白藜蘆醇的工藝[5]、白藜蘆醇定量測定方法建立[11-12]以及體外抗氧化活性研究[7]，但是花生紅衣中白藜蘆醇的體外抗氧化活性及反應(yīng)動力學(xué)尚未見報道。此次試驗在超聲波輔助提取花生紅衣中白藜蘆醇[12]的基礎(chǔ)上，采用體外抗氧化活性評價方法測定白藜蘆醇的抗氧化活性，及DPPH自由基消除法研究白藜蘆醇與自由基的反應(yīng)動力學(xué)，以期為白藜蘆醇在食品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

二苯基苦味?；诫拢?, 1-Diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH）、白藜蘆醇（Resveratrol，Res，98%）、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（Butylated hydroxytoluene，BHT），購于百靈威公司；無水乙醇、磷酸、高硫酸鉀、磷酸鈉、鉬酸銨、硫酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸等均為分析純，購于隴西化工股份有限公司。

1.2 主要儀器和設(shè)備

TP-214型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；B-260型恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；UV-3100PC紫外-可見分光光度計（上海美普達(dá)有限公司）；LXJ-IIB型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 DPPH·清除率的測定

DPPH·清除試驗根據(jù)Hatano等[13]提出的方法制定。在樣品管中加入一定量的樣品和DPPH·溶液，搖勻并在30 ℃放置30 min。在515 nm處測定不同濃度樣品與DPPH·反應(yīng)后的吸光度、樣品在無水乙醇溶劑中的吸光度、DPPH·在無水乙醇溶劑中的吸光度，以無水乙醇溶劑為空白樣品，BHT為參照物，每次處理重復(fù)3次。

式中：D空白為DPPH·與溶劑混合液的吸光度；D樣品表示DPPH·與樣品反應(yīng)后的吸光度；D對照為樣品與溶劑混合的吸光度。

1.3.2 總抗氧化能力的測定[14]

分別取1.0 mL不同樣品溶液加入10 mL離心管中，再加入3.0 mL磷鉬試劑溶液（磷鉬試劑溶液中包括0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨），混合均勻，混合液在95 ℃水浴鍋中分別水浴30，60，90，120，150和180 min，放置冷至室溫，在695 nm處檢測樣品的吸光度，以蒸餾水為空白，BHT為對照，將試驗重復(fù)3次，求平均值。

1.3.3 還原性能力的測定[15]

在10 mL離心管中分別加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液和1 mL不同濃度的樣品液，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后放置50 ℃反應(yīng)20 min，取出冷卻至室溫后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，以4 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測樣品的吸光度，BHT作為對照。

1.3.4 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精確稱取9.06 mg DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇在燒杯中溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中，再用無水乙醇定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為90.6 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別取0，2，4，6，8和10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容，在517 nm處測定其吸光度，以濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度D為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程D=0.010 13C-0.017 81，R2=0.998。

1.3.5 DPPH·法[16]

在DPPH·溶液（濃度為60 μmol/L）中加入不同體積的白藜蘆醇溶液（濃度為0.01 mol/L），在517 nm處測定DPPH·吸光度隨時間的變化情況，直到DPPH·的吸光度達(dá)到穩(wěn)定。溶液中DPPH·的剩余率可由式（2）計算得出：

式中：Df為穩(wěn)定態(tài)時DPPH·的吸光度；D0為初始時DPPH·的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇體外抗氧化活性研究

2.1.1 DPPH·清除率

DPPH·是一種以氮為中心的穩(wěn)定自由基，其乙醇溶液為紫紅色，在波長515 nm處有最大吸光度。此方法是基于抗氧化劑給自由基提供氫原子或電子引起紫紅色消褪來檢測樣品的抗氧化活性大小。自由基分為羥基自由基、烷基自由基和過氧自由基。若提取物能夠降低DPPH·的最大吸光度，則表示它含有降低羥基自由基、烷基自由基和過氧自由基有效濃度的能力，可以有效防止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而抑制氧化過程。抗氧化劑清除DPPH·的清除率越高，其抗氧化能力越強。圖1表明白藜蘆醇和BHT對DPPH·都有較高的清除能力，清除率與抗氧化劑的含量呈正相關(guān)性，隨著抗氧化劑含量的增加，其對DPPH·的清除力也逐漸增強。白藜蘆醇對DPPH·的清除率明顯高于BHT對DPPH·的清除率。

圖1 不同樣品清除DPPH·的量效關(guān)系圖

2.1.2 總抗氧化能力

磷鉬絡(luò)合物法通常用于一些酚類、VE和類胡蘿卜素等抗氧化物的抗氧化活性測定，其原理是抗氧化物質(zhì)中的氫或電子轉(zhuǎn)移到Mo（Ⅵ），將其還原生成綠色的Mo（Ⅴ）絡(luò)合物，最大吸收波長為695 nm，吸光度越大，表示抗氧化劑的活性越強。圖2表明隨著反應(yīng)時間增加，白藜蘆醇和BHT溶液的吸光度增大，即抗氧化劑的抗氧化活性也逐漸增強。白藜蘆醇和BHT具有較高的抗氧化活性，但白藜蘆醇的抗氧化活性高于BHT。

2.1.3 還原性能力

還原能力的測定是為了檢驗樣品是否是一個良好的電子供給體，還原能力強說明樣品是個良好的電子供給體，供給電子除把Fe3+還原成Fe2+外，還可與自由基反應(yīng)，生成穩(wěn)定的物質(zhì)。一般情況下，樣品的還原能力與其抗氧化活性存在一定的相關(guān)性，樣品還原能力的高低可間接反映其抗氧化能力的強弱。白藜蘆醇和BHT的還原能力如圖3所示。在所檢測的濃度范圍內(nèi)，隨著加入抗氧化劑濃度的增加，溶液吸光度也逐漸升高，則表明樣品的還原能力逐漸增強。當(dāng)檢測樣品質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL時，白藜蘆醇和BHT在700 nm處對應(yīng)的吸光度分別為0.884和0.788，表明在相同濃度下白藜蘆醇的還原能力強于BHT的還原能力，這一結(jié)果與2.1.2的試驗結(jié)果相一致。

圖2 不同樣品的總抗氧化能力

圖3 不同樣品還原能力的量效關(guān)系圖

2.2 白藜蘆醇與DPPH自由基的反應(yīng)動力學(xué)研究

2.2.1 反應(yīng)時間影響

不同濃度的白藜蘆醇對DPPH的消除反應(yīng)如圖4所示。隨著反應(yīng)時間的延長，溶液中DPPH·的吸光度逐漸減弱，即白藜蘆醇對DPPH·的消除率逐漸增大，當(dāng)反應(yīng)超過6 h后體系趨于平衡，即體系中DPPH·的濃度基本保持不變，此反應(yīng)被稱為一個慢反應(yīng)[16]。

2.2.2 白藜蘆醇濃度影響

圖5顯示白藜蘆醇濃度對DPPH·清除能力的影響，反應(yīng)時間固定30 min。由圖4和圖5可知，白藜蘆醇抗氧化劑對DPPH·的消除能力隨自身濃度的增加而升高。當(dāng)白藜蘆醇濃度較低時，其對DPPH·的消除率增幅較大；隨白藜蘆醇濃度的繼續(xù)增加，其對DPPH·的消除率增幅相對變小。這是由于反應(yīng)初始，體系中DPPH·的濃度較大，反應(yīng)向正方向反應(yīng)移動，隨著體系中DPPH·的濃度降低，反應(yīng)向正反應(yīng)進(jìn)行的速度減慢，即白藜蘆醇抗氧化劑對DPPH·的消除率增幅變小[16]。由圖4和圖5曲線擬合計算得到白藜蘆醇的半消除率濃度EC50為0.047±0.004 μmol antioxidant/μmol DPPH·，反應(yīng)化學(xué)計量數(shù)為0.094±0.07，抗自由基能力（Antiradical power，ARP）為21.28±0.27。

圖4 DPPH·加入不同濃度的白藜蘆醇后隨時間變化情況

圖5 反應(yīng)時間為30 min，白藜蘆醇濃度對清除DPPH·能力的影響

2.2.3 反應(yīng)級數(shù)及反應(yīng)速率常數(shù)

白藜蘆醇與DPPH·的消除反應(yīng)可由式（3）表示：

反應(yīng)速度方程應(yīng)遵守：

式中：k為反應(yīng)速度常數(shù)；c為反應(yīng)物濃度，μmol/L。

由式（3）可得出：

當(dāng)[AH]?[DPPH·]時，反應(yīng)可假設(shè)為一級反應(yīng)，則：

式中：[DPPH·]0為DPPH·的初始濃度，μmol/L；[DPPH·]t為反應(yīng)時間t時的DPPH·濃度，μmol/L；kobs為一級反應(yīng)速率常數(shù)；t表示反應(yīng)時間，h。

以ln[DPPH·]0/[DPPH·]t對t作圖，如圖6所示?？芍?，ln[DPPH·]0/[DPPH·]t與t基本呈線性關(guān)系，得出反應(yīng)速率常數(shù)kobs為5.85×10-3±0.04 μmol/L-1·s-1，R2為0.994，因此該反應(yīng)符合一級反應(yīng)動力學(xué)模式。

圖6 白藜蘆醇對清除DPPH·反應(yīng)的ln[DPPH·]0/[DPPH·]t-t圖

2.3 白藜蘆醇清除DPPH·反應(yīng)機理推測

圖7 白藜蘆醇與DPPH·反應(yīng)機理推測

白藜蘆醇屬于酚類化合物，其抗氧化機理分為兩類，即抽氫反應(yīng)機理和單電子質(zhì)子轉(zhuǎn)移機理。抽氫反應(yīng)機理是先將抗氧化劑與自由基反應(yīng)，通過OH鍵上的H轉(zhuǎn)移到自由基上，抗氧化劑清除自由基的能力取決于羥基提供氫的能力，這主要與羥基的羥基鍵解離能、反應(yīng)的活化能和反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)摩爾反應(yīng)熱數(shù)據(jù)有關(guān)[17]。單電子質(zhì)子轉(zhuǎn)移機理是在溶劑體系中，溶劑分子尤其是極性溶劑分子與抗氧化劑分子之間形成分子間氫鍵，阻礙了抽氫反應(yīng)發(fā)生，故反應(yīng)轉(zhuǎn)向電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)[18]，但DPPH·與酚類化合物主要是通過抽氫反應(yīng)機理來進(jìn)行反應(yīng)的。裴玲等[19]、徐順等[20]、曹曼等[21]都通過理論計算得出白藜蘆醇中4'位羥基的活性高于3, 5位羥基的活性。結(jié)合試驗和理論研究結(jié)果，對白藜蘆醇與DPPH·反應(yīng)進(jìn)行了以下推測，分為三個步驟（圖7）：首先，白藜蘆醇上的一個酚羥基失去一個質(zhì)子，DPPH·接受這個質(zhì)子形成DPPH-H，此反應(yīng)為速率決定反應(yīng)（反應(yīng)a）；然后失去一個質(zhì)子的白藜蘆醇結(jié)構(gòu)重排，即烯鍵上的碳失去質(zhì)子，再跟一個DPPH·分子發(fā)生反應(yīng)，即反應(yīng)b；最后發(fā)生結(jié)構(gòu)重排的白藜蘆醇分子相互反應(yīng)形成一個多酚化合物，這個反應(yīng)可能由于空間位阻較大，反應(yīng)很慢甚至不會發(fā)生反應(yīng)。此推論還需其他更多的檢測結(jié)果來支持這個結(jié)論；另外，失去一個質(zhì)子的白藜蘆醇發(fā)生結(jié)構(gòu)重排生成一個單醌結(jié)構(gòu)的化合物。

3 結(jié)論

綜合分析各項試驗結(jié)果得出花生紅衣中白藜蘆醇的抗氧化活性強于BHT，白藜蘆醇和DPPH自由基的消除反應(yīng)是一級反應(yīng)。從試驗與機理角度探討了白藜蘆醇與DPPH自由基的消除反應(yīng)機理，推測4'位羥基的活性大于其他位的羥基，更容易與自由基發(fā)生反應(yīng)，但其仍是個相對復(fù)雜的過程。今后將更深入地研究白藜蘆醇與DPPH自由基的作用機制，從而更清楚地闡明其工作機制，為改造和開發(fā)富含白藜蘆醇的產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供更有利的理論基礎(chǔ)。