楊樹(shù)桑黃的ITS特異性標(biāo)記及生物學(xué)特性

陸娜，宋吉玲，袁衛(wèi)東

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024)

楊樹(shù)桑黃(Sanghuangporusvaninii)，是一種生長(zhǎng)在楊樹(shù)上的藥用真菌，俗稱(chēng)為楊黃，屬擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)[1-2]，是桑黃真菌屬的一個(gè)種，桑黃真菌屬是我國(guó)一類(lèi)傳統(tǒng)藥用真菌，具有抗菌、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等作用，民間多用桑黃類(lèi)真菌水煎液來(lái)輔助防癌和抗癌治療[3]，也有報(bào)道楊黃具有與傳統(tǒng)桑樹(shù)桑黃(Sanghuangporussanghuang)同樣的抑制腫瘤的功效[1,4]。

楊黃(S.vaninii)和桑黃(S.sanghuang)的子實(shí)體外觀形態(tài)差異不明顯，僅憑子實(shí)體外觀難以準(zhǔn)確鑒定[5-6]。目前，楊黃(S.vaninii)作為已大面積投產(chǎn)的藥用菌，其遺傳多樣性評(píng)價(jià)以及利用是其育種領(lǐng)域中一個(gè)重要的研究方向[7]。筆者曾對(duì)楊黃(S.vaninii)和桑黃(S.sanghuang)ITS進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，二者的ITS1-5.8S-ITS2序列分別為814 bp和773 bp，堿基相差40 bp左右，很難利用通用引物對(duì)(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR擴(kuò)增、普通電泳來(lái)進(jìn)行準(zhǔn)確辨別；對(duì)其ITS序列比對(duì)顯示，二者的局部序列存在較大差異，因此，利用ITS特異引物，針對(duì)性地?cái)U(kuò)增ITS特異片段，有助于楊黃(S.vaninii)的分子輔助鑒定。本試驗(yàn)運(yùn)用可辨別楊黃(S.vaninii)與桑黃(S.sanghuang)的分子特異性標(biāo)記引物，對(duì)16株供試菌株進(jìn)行快速辨別，為楊黃(S.vaninii)育種及生產(chǎn)提供便捷。通過(guò)對(duì)其生物學(xué)特性的研究，最終確定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的楊黃(S.vaninii)品種，實(shí)現(xiàn)該資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及其來(lái)源

供試的16個(gè)菌株為杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所菌種站收集、保藏的楊黃、桑黃菌株(表1)。

表1 供試菌株的名稱(chēng)及來(lái)源

1.1.2 培養(yǎng)料配方

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉13 g、水1 L。

1.1.3 主要試劑及引物

研究所用主要分子生物學(xué)試劑包括新型快速植物基因組DNA提取試劑(BioTeke，北京)、PCR擴(kuò)增試劑2’PowerTaqPCR MasterMix(BioTeke，北京)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

利用PDA培養(yǎng)基，按常規(guī)平板培養(yǎng)基制作方法配制，每個(gè)菌株設(shè)5個(gè)重復(fù)，接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)。分別于接種后定期觀察各菌株長(zhǎng)勢(shì)、顏色，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，菌絲生長(zhǎng)速度=菌落半徑(mm)/生長(zhǎng)天數(shù)(d)，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)分為稀疏、較濃密、濃密，用新復(fù)極差法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.2 基因組DNA的提取及濃度測(cè)定

供試的16個(gè)菌株取待測(cè)菌絲體樣品0.2 g，加液氮徹底磨碎，利用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(BioTeke，北京)的說(shuō)明提取樣品的基因組DNA，提取后的DNA測(cè)定濃度，并經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 辨別楊黃(S.vaninii)與桑黃(S.sanghuang)的分子特異性標(biāo)記引物及檢測(cè)方法

提取的16個(gè)菌株基因組DNA為模板，辨別楊黃(S.vaninii)與桑黃(S.sanghuang)的分子特異性標(biāo)記引物作為擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物序列為5′-TGCGCATGTGCACGGCCTT-3′；下游引物序列為5′-AGGAGGTAACAACAACTCCTT-3′。PCR反應(yīng)體系每20 μL組成如下：2×PowerTaqPCR Master Mix 10 μL(PR1700，BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)、10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、20 ng·μL-1模板DNA 3 μL、ddH2O 5 μL。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性40 s，54.8 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃補(bǔ)平7 min，終止溫度為4 ℃，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。

取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，與1 μL 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1×TAE緩沖液中、5 V·cm-1電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動(dòng)凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)651 bp的DNA條帶，則待測(cè)標(biāo)本為楊黃(S.vaninii)，若電泳結(jié)果未出現(xiàn)651 bp的DNA條帶，則待測(cè)標(biāo)本為桑黃(S.sanghuang)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定性試驗(yàn)

按照楊黃分子特異性標(biāo)記引物及檢測(cè)方法，分別對(duì)16個(gè)樣品菌株進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，其中，編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、的樣品擴(kuò)增出長(zhǎng)度為651 bp的特殊DNA條帶，而編號(hào)為9、10、11、13、14、15的樣品未擴(kuò)增出長(zhǎng)度為651 bp的特殊DNA條帶。說(shuō)明供試樣品中1～8、12及16號(hào)樣品為楊黃，9、10、11、13、14、15為桑黃。

采用的Marker片段長(zhǎng)度由上至下為2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp。圖1 辨別設(shè)計(jì)特異引物的ITS-PCR擴(kuò)增圖譜

為了保證桑黃菌株鑒定的可靠性，采用通用型引物對(duì)桑黃6個(gè)菌株進(jìn)行了重復(fù)試驗(yàn)，如圖2所示，其中13號(hào)菌株在1 000 bp位置有一條帶，其余品種均在1 000 bp以下，由于桑黃菌株在通用型引物下不會(huì)產(chǎn)生大于1 000 bp條帶，故13號(hào)菌株非楊黃或桑黃菌株。

采用的Marker片段長(zhǎng)度由上至下為2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp。圖2 通用引物下ITS-PCR擴(kuò)增圖譜

2.2 楊黃菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定

由表2可知，鑒定為楊黃的10個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基上菌絲平均生長(zhǎng)速度最快的是5號(hào)菌株，達(dá)0.203 cm·d-1，其次是8號(hào)和12號(hào)菌株，分別為0.193 cm·d-1和0.187 cm·d-1，生長(zhǎng)最慢的是6號(hào)菌株，僅為0.157 cm·d-1，方差分析表明，各菌株存在顯著差異。從菌絲長(zhǎng)勢(shì)來(lái)看，2、5、8號(hào)等菌株菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲濃密度高，3、4、16號(hào)菌絲長(zhǎng)勢(shì)較弱。

表2 不同菌株菌絲的生長(zhǎng)情況

2.3 各菌株產(chǎn)量比較

由表3可以看出，各參試菌株之間在產(chǎn)量方面存在顯著差異，12號(hào)菌株產(chǎn)量最高，達(dá)13 490 g，單包平均產(chǎn)量達(dá)14.2 g·包-1；其次為8號(hào)菌株，產(chǎn)量達(dá)1 146.6 g，單包平均產(chǎn)量達(dá)12.6 g·包-1，其他菌株表現(xiàn)一般，特別是4號(hào)、6號(hào)品種，污染率高，產(chǎn)量低，單包平均產(chǎn)量?jī)H為1.4和1.2 g·包-1。

表3 不同菌株出菇產(chǎn)量(干品)的比較

3 小結(jié)

ITS特異性標(biāo)記引物可用于相似種間的分子識(shí)別，我們利用ITS特異性標(biāo)記引物鑒定了浙江、武漢及福建等地采集到的16個(gè)菌株樣品，結(jié)果表明，供試樣品中1～8、12及16號(hào)菌株為楊黃(S.vaninii)，9、10、11、14、15號(hào)菌株為桑黃(S.sanghuang)，13號(hào)菌株非楊黃或桑黃菌株。通過(guò)10個(gè)楊黃(S.vaninii)菌株菌絲生長(zhǎng)勢(shì)、產(chǎn)量進(jìn)行比較試驗(yàn)，各參試菌株之間在產(chǎn)量方面存在顯著差異，12號(hào)菌株(S太)產(chǎn)量最高，單包平均產(chǎn)量達(dá)14.2 g·包-1，8號(hào)菌株(S14)表現(xiàn)其次，單包平均產(chǎn)量達(dá)12.6 g·包-1，其他菌株表現(xiàn)一般，4號(hào)、6號(hào)品種污染率高，產(chǎn)量低。說(shuō)明S太和S14產(chǎn)量表現(xiàn)好，具有較好的推廣價(jià)值。