楊樹桑黃的ITS特異性標記及生物學(xué)特性

陸娜，宋吉玲，袁衛(wèi)東

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024)

楊樹桑黃(Sanghuangporusvaninii)，是一種生長在楊樹上的藥用真菌，俗稱為楊黃，屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)[1-2]，是桑黃真菌屬的一個種，桑黃真菌屬是我國一類傳統(tǒng)藥用真菌，具有抗菌、抗氧化、增強免疫力等作用，民間多用桑黃類真菌水煎液來輔助防癌和抗癌治療[3]，也有報道楊黃具有與傳統(tǒng)桑樹桑黃(Sanghuangporussanghuang)同樣的抑制腫瘤的功效[1,4]。

楊黃(S.vaninii)和桑黃(S.sanghuang)的子實體外觀形態(tài)差異不明顯，僅憑子實體外觀難以準確鑒定[5-6]。目前，楊黃(S.vaninii)作為已大面積投產(chǎn)的藥用菌，其遺傳多樣性評價以及利用是其育種領(lǐng)域中一個重要的研究方向[7]。筆者曾對楊黃(S.vaninii)和桑黃(S.sanghuang)ITS進行測序，結(jié)果顯示，二者的ITS1-5.8S-ITS2序列分別為814 bp和773 bp，堿基相差40 bp左右，很難利用通用引物對(如ITS1/ITS4或ITS5/ITS4)的PCR擴增、普通電泳來進行準確辨別；對其ITS序列比對顯示，二者的局部序列存在較大差異，因此，利用ITS特異引物，針對性地擴增ITS特異片段，有助于楊黃(S.vaninii)的分子輔助鑒定。本試驗運用可辨別楊黃(S.vaninii)與桑黃(S.sanghuang)的分子特異性標記引物，對16株供試菌株進行快速辨別，為楊黃(S.vaninii)育種及生產(chǎn)提供便捷。通過對其生物學(xué)特性的研究，最終確定高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的楊黃(S.vaninii)品種，實現(xiàn)該資源的可持續(xù)開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及其來源

供試的16個菌株為杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所菌種站收集、保藏的楊黃、桑黃菌株(表1)。

表1 供試菌株的名稱及來源

1.1.2 培養(yǎng)料配方

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉13 g、水1 L。

1.1.3 主要試劑及引物

研究所用主要分子生物學(xué)試劑包括新型快速植物基因組DNA提取試劑(BioTeke，北京)、PCR擴增試劑2’PowerTaqPCR MasterMix(BioTeke，北京)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲生長速度測定

利用PDA培養(yǎng)基，按常規(guī)平板培養(yǎng)基制作方法配制，每個菌株設(shè)5個重復(fù)，接種后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)。分別于接種后定期觀察各菌株長勢、顏色，測量菌落直徑，計算菌絲生長速度，菌絲生長速度=菌落半徑(mm)/生長天數(shù)(d)，菌絲生長勢分為稀疏、較濃密、濃密，用新復(fù)極差法對試驗結(jié)果進行差異顯著性分析。

1.2.2 基因組DNA的提取及濃度測定

供試的16個菌株取待測菌絲體樣品0.2 g，加液氮徹底磨碎，利用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(BioTeke，北京)的說明提取樣品的基因組DNA，提取后的DNA測定濃度，并經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 辨別楊黃(S.vaninii)與桑黃(S.sanghuang)的分子特異性標記引物及檢測方法

提取的16個菌株基因組DNA為模板，辨別楊黃(S.vaninii)與桑黃(S.sanghuang)的分子特異性標記引物作為擴增引物，進行PCR擴增，上游引物序列為5′-TGCGCATGTGCACGGCCTT-3′；下游引物序列為5′-AGGAGGTAACAACAACTCCTT-3′。PCR反應(yīng)體系每20 μL組成如下：2×PowerTaqPCR Master Mix 10 μL(PR1700，BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)、10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL、20 ng·μL-1模板DNA 3 μL、ddH2O 5 μL。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性40 s，54.8 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；最后于72 ℃補平7 min，終止溫度為4 ℃，獲得擴增產(chǎn)物。

取擴增產(chǎn)物5 μL，與1 μL 0.25%溴酚蘭緩沖液混勻，點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1×TAE緩沖液中、5 V·cm-1電壓下電泳，電泳結(jié)束后EB染色，于自動凝膠圖像分析儀上照相，若電泳結(jié)果出現(xiàn)651 bp的DNA條帶，則待測標本為楊黃(S.vaninii)，若電泳結(jié)果未出現(xiàn)651 bp的DNA條帶，則待測標本為桑黃(S.sanghuang)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鑒定性試驗

按照楊黃分子特異性標記引物及檢測方法，分別對16個樣品菌株進行檢測，電泳結(jié)果見圖1，其中，編號為1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、的樣品擴增出長度為651 bp的特殊DNA條帶，而編號為9、10、11、13、14、15的樣品未擴增出長度為651 bp的特殊DNA條帶。說明供試樣品中1～8、12及16號樣品為楊黃，9、10、11、13、14、15為桑黃。

采用的Marker片段長度由上至下為2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp。圖1 辨別設(shè)計特異引物的ITS-PCR擴增圖譜

為了保證桑黃菌株鑒定的可靠性，采用通用型引物對桑黃6個菌株進行了重復(fù)試驗，如圖2所示，其中13號菌株在1 000 bp位置有一條帶，其余品種均在1 000 bp以下，由于桑黃菌株在通用型引物下不會產(chǎn)生大于1 000 bp條帶，故13號菌株非楊黃或桑黃菌株。

采用的Marker片段長度由上至下為2 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp。圖2 通用引物下ITS-PCR擴增圖譜

2.2 楊黃菌絲生長速度測定

由表2可知，鑒定為楊黃的10個菌株在PDA培養(yǎng)基上菌絲平均生長速度最快的是5號菌株，達0.203 cm·d-1，其次是8號和12號菌株，分別為0.193 cm·d-1和0.187 cm·d-1，生長最慢的是6號菌株，僅為0.157 cm·d-1，方差分析表明，各菌株存在顯著差異。從菌絲長勢來看，2、5、8號等菌株菌絲長勢最好，菌絲濃密度高，3、4、16號菌絲長勢較弱。

表2 不同菌株菌絲的生長情況

2.3 各菌株產(chǎn)量比較

由表3可以看出，各參試菌株之間在產(chǎn)量方面存在顯著差異，12號菌株產(chǎn)量最高，達13 490 g，單包平均產(chǎn)量達14.2 g·包-1；其次為8號菌株，產(chǎn)量達1 146.6 g，單包平均產(chǎn)量達12.6 g·包-1，其他菌株表現(xiàn)一般，特別是4號、6號品種，污染率高，產(chǎn)量低，單包平均產(chǎn)量僅為1.4和1.2 g·包-1。

表3 不同菌株出菇產(chǎn)量(干品)的比較

3 小結(jié)

ITS特異性標記引物可用于相似種間的分子識別，我們利用ITS特異性標記引物鑒定了浙江、武漢及福建等地采集到的16個菌株樣品，結(jié)果表明，供試樣品中1～8、12及16號菌株為楊黃(S.vaninii)，9、10、11、14、15號菌株為桑黃(S.sanghuang)，13號菌株非楊黃或桑黃菌株。通過10個楊黃(S.vaninii)菌株菌絲生長勢、產(chǎn)量進行比較試驗，各參試菌株之間在產(chǎn)量方面存在顯著差異，12號菌株(S太)產(chǎn)量最高，單包平均產(chǎn)量達14.2 g·包-1，8號菌株(S14)表現(xiàn)其次，單包平均產(chǎn)量達12.6 g·包-1，其他菌株表現(xiàn)一般，4號、6號品種污染率高，產(chǎn)量低。說明S太和S14產(chǎn)量表現(xiàn)好，具有較好的推廣價值。