HCV感染者直接抗病毒藥物治療前后CD8+T淋巴細胞衰老和功能相關指標的變化

張沛欣，邊培育，葉傳濤，鄭煦暘，范 超，張 穎，賈戰生，周 云

空軍軍醫大學第二附屬醫院 傳染科，西安 710038

HCV是黃病毒屬單股正鏈噬肝RNA病毒，會引起高比例的慢性丙型肝炎(超過80%)。它是導致肝纖維化、肝硬化、肝細胞癌的主要原因，在許多國家是肝移植最常見的指征。HCV感染后，機體能夠產生固有免疫和適應性免疫反應。固有免疫作用包括抗原遞呈細胞和自然殺傷細胞引起的細胞毒作用，導致感染細胞裂解和自然殺傷細胞分泌IFNγ等細胞因子，抑制HCV復制。適應性免疫作用則產生病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞，特異性地識別和裂解感染細胞，產生病毒特異性抗體，中和細胞外的病毒顆粒。本研究小組[1]此前發現，沉默信息調節因子2相關酶1(sirtuin1,SIRT1)在HCV感染者CD4+T淋巴細胞上表達增高，抵抗細胞衰老。SIRT1在CD8+T淋巴細胞上的表達情況尚無研究。大量研究表明，HCV特異性CD8+T淋巴細胞免疫功能障礙是機體無法徹底清除病毒，導致持續感染的主要原因，其機制包括天然免疫的不足、病毒逃逸突變、抑制性受體的表達、CD4+輔助性T淋巴細胞免疫輔助功能受損、細胞因子的負性調節作用等[2]。本研究擬檢測并比較HCV感染者經直接抗病毒藥物(DAA)治療前后CD8+T淋巴細胞衰老、負性調節因子相關指標的變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月-2018年12月于空軍軍醫大學第二附屬醫院就診的HCV感染者及治愈者的血清和外周血單個核細胞(PBMC)，診斷標準依據《2016年歐洲肝病學會丙型肝炎治療指南》[3]。實驗分為HCV感染者、HCV治愈者和健康對照組。抗HCV治療采用索磷布韋聯合達卡他韋方案。治愈者指慢性丙型肝炎患者完成12周抗病毒治療，達到病毒學應答，HCV RNA均低于檢測下限，肝功能指標ALT、AST正常。

1.2 試劑與方法

1.2.1 主要試劑 流式抗體CD3、CD4、CD8、CD57，SIRT1等購自美國BD公司；反轉錄PCR(RT-PCR)的 p53、p21引物購自上海生工公司；用于磁珠分選細胞的CD8+T淋巴細胞分離試劑盒購自德國美天旎公司，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒，定量反轉錄PCR(qRT-PCR)試劑盒購自德國Qiagen公司，Luminex液相懸浮芯片檢測由上海華盈生物醫藥科技有限公司提供。RPMI1640等常規細胞培養基、無抗生素無血清的OPT-MEM Ⅰ培養液、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2.2 流式細胞術檢測CD8+T淋巴細胞SIRT1、CD57、PD-1、Tim-3的表達 Ficoll-Pague密度梯度離心法分離外周血中的PBMC，洗滌后加入CD8、CD57、PD-1表面抗體，4 ℃避光孵育30 min后洗滌，1500 r/min離心5 min 后棄上清。SIRT1、Tim-3為胞內染色，用Inside Stain kit中的固定液4℃固定30 min，1500 r/min離心5 min后棄上清；加破膜液180 μl，1500 r/min離心5 min后棄上清。加50 μl 破膜液，加SIRT1、Tim-3抗體，室溫避光孵育30 min，1500 r/min離心5 min后棄上清，加流式緩沖液，上機檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測p53、p21 mRNA的表達 以CD8+T淋巴細胞分離試劑盒分離PBMC中的CD8+T淋巴細胞，用TRIzol提取RNA，逆轉錄成cDNA，通過RT-PCR檢測各組細胞衰老相關信號p53、p21 mRNA的表達水平。設計GAPDH、p53、p21分子的qRT-PCR引物，GAPDH上游引物：5′-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物：5′-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-3′；p53 上游引物：5′-AGCGCTTCGAGATGTTCCGA-3′,下游引物：5′-TTCAGGTGGCTGGAGTGAGC-3′；p21 上游引物：5′-GGGATGTCCGTCAGAACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTCCAGTGGTGTCTCG-3′。RT-PCR反應條件: 95 ℃ 5 min，進入循環95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，共循環42次，60 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s。生成擴增曲線及熔解曲線，得出Ct值，各目的基因的表達量與內參基因GAPDH進行標準化，得到各基因的相對表達量。

1.2.4 Luminex液相懸浮芯片檢測外周血衰老相關的分泌表型(senescence associated secretory phenotype，SASP)為檢測3組人群SASP，按照Luminex液相懸浮芯片檢測試劑盒操作手冊制備樣品和標準品，取微珠在振蕩器上 1400 r/min，振蕩30 s，使用RD2-1稀釋微珠；用振蕩器1400 r/min，再次震蕩30 s，每孔50 μl加入96孔板中；取50 μl準備好的標曲、樣品和 Blank 加入對應孔中，850 r/min振蕩，避光，室溫孵育2 h。洗滌，每孔加入50 μl稀釋好的Biotin Antibody Cocktail，850 r/min振蕩，避光，室溫孵育1 h。洗滌后每孔加入50 μl稀釋好的Streptavidin-PE，850 r/min振蕩，避光，室溫孵育30 min，洗滌后送入已校正的Luminex 200機器中讀值。

1.3 倫理學審查 本研究經空軍軍醫大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準(批號：TDLL-2016142)，并與患者及健康對照者簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入HCV感染者26例，HCV治愈者22例，健康對照者20例。各組男女比例及年齡、HCV RNA定量、基因分型和肝功能指標見表1。

2.2 外周血CD8+T淋巴細胞計數 流式細胞儀檢測健康對照組12例、HCV組18例、HCV治愈組15例3組人群PBMC中CD8+T淋巴細胞的水平，3組間差異無統計學意義(F=0.081，P=0.922)(圖1)。

2.3 CD8+T淋巴細胞上SIRT1、CD57、PD-1、Tim-3的表達水平 流式細胞儀檢測健康對照組12例、HCV組18例、HCV治愈組15例3組人群CD8+T淋巴細胞上SIRT1、CD57、PD-1、Tim-3的表達水平(圖2)。SIRT1在3組間差異有統計學意義(F=6.712，P=0.003),與健康對照相比，HCV組SIRT1表達水平明顯升高(P<0.001)，經治療后，HCV治愈組表達水平下降，且與HCV組相比差異有統計學意義(P<0.05)，HCV治愈組與健康對照組比較，SIRT1表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。CD57在3組間差異無統計學意義(F=0.203，P=0.817)。PD-1在3組間差異有統計學意義(F=4.202，P=0.022)，與健康組相比，PD-1在HCV組明顯升高(P=0.008)，經治療后略有下降，HCV治愈組與健康對照組、HCV組比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)。Tim-3在3組間差異有統計學意義(F=4.575，P=0.016)，與健康對照組相比，Tim-3在HCV組(P=0.005)和HCV治愈組(P=0.047)均升高，HCV組和HCV治愈組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組一般臨床資料

2.4 CD8+T淋巴細胞上p53及p21的表達水平 RT-PCR檢測健康對照組、HCV組及治愈組3組人群CD8+T淋巴細胞上p53及p21的表達，每組8例(圖3)。結果顯示，p53表達倍數變化在3組間差異有統計學意義(F=11.144，P<0.001)，HCV組及HCV治愈組p53表達水平較健康對照組明顯下降(P值均<0.001)。p21表達倍數變化在3組間差異有統計學意義(F=6.594，P=0.006)，HCV組及HCV治愈組p21表達水平較健康對照組明顯下降(P值均<0.05)。

2.5 外周血SASP相關分子的表達水平 Luminex液相懸浮芯片檢測外周血SASP，包括IL-2、IL-6、CXCL1 GRO、TNFα(圖4)。其中健康對照組20例，HCV組21例，治愈組22例，IL-2、CXCL1 GRO在3組間差異均無統計學意義(F值分別為0.748、0.616，P值均>0.05)。IL-6在3組間差異有統計學意義(F=3.920，P=0.025)，HCV組較健康對照組明顯升高(P=0.007)，HCV治愈組與HCV組、健康對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。TNFα在3組間差異有統計學意義(F=6.337，P=0.003)，HCV組較健康對照組和HCV治愈組均明顯升高(P值均<0.05)，HCV治愈組與健康對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

研究[4]發現肝硬化的HCV患者CD8+T淋巴細胞功能受損，CD8+T淋巴細胞亞群比例改變。通過DAA治療后，其受損的CD8+T淋巴細胞功能并無好轉，表現為CD107a及穿孔蛋白減少。DAA治療對于提高炎性因子和降低抑制性分子TGFβ并無效果。在慢性HCV感染過程中，肝纖維化的嚴重性與CD8+T淋巴細胞的功能亢進相關，經DAA治療后，即使病毒已清除，這種效應仍持續存在。本試驗檢測了DAA治療前后，CD8+T淋巴細胞計數在健康對照者、HCV感染者、HCV治愈者3組人群中并無差異。

Sirtuin蛋白是一組具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性的組蛋白去乙酰基轉移酶，參與機體一系列生物學活動，在調控衰老和壽命方面發揮重要作用。SIRT1通過多種信號通路參與炎癥反應、新陳代謝、細胞增殖、凋亡和衰老等過程。SIRT1與衰老關系密切，且在衰老細胞中表達減少。p53作為重要的抑癌基因，在多種細胞損傷應激反應中通過引起細胞周期阻滯和細胞凋亡來維持基因組的穩定性。作為SIRT1主要底物，p53的功能發揮取決于其活性，p53的乙酰化在癌基因誘導細胞衰老和復制性衰老中都起關鍵作用，且能被 SIRT1抑制[5]。SIRT1對p53的去乙酰化可阻止其對衰老的誘導。p21是p53最經典的靶基因，亦是細胞周期抑制因子。在DNA 損傷、缺氧及癌基因激活等刺激下，p53對細胞周期G1監測點的調控主要由p21介導[6]。p21的過表達則可導致細胞周期阻滯，并出現一系列衰老征象，如衰老相關β-半乳糖苷酶活性增加，細胞扁平、脹大等。有研究[7]發現，持續感染將導致CD8+T淋巴細胞衰老，在HCV慢性感染者中，CD4+T淋巴細胞的端粒長度和肝硬化的進展與臨床預后不佳相關。筆者團隊[1]此前也發現HCV感染者CD4+T淋巴細胞比健康對照者端粒長度短，衰老細胞更多，但SIRT1的表達比健康對照者更高。有學者[8]研究了在HCV感染者的肝組織中T淋巴細胞周期性蛋白抑制劑p21、p27、p16，發現隨著纖維化程度增加，p21表達增加。也有學者[9]發現HCV特異性CD4+T淋巴細胞和 CD8+T淋巴細胞高表達PD-1。HCV感染者CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞中后期分化的T淋巴細胞明顯增多，提示免疫衰老。此外，還發現血漿中病毒載量與T淋巴細胞上CD57、PD-1的表達水平呈正相關。

本研究中HCV組與健康對照組相比，外周CD8+T淋巴細胞上SIRT1表達上升，經過治療，HCV治愈組SIRT1表達水平下降，且與HCV組相比差異有統計學意義，與健康對照組無顯著性差異。衰老標志分子CD57在3組間無統計學差異。HCV感染組及治愈組CD8+T淋巴細胞上p53、p21水平較健康對照組下降。推測在HCV感染后，外周循環CD8+T淋巴細胞衰老，導致SIRT1反應性增高，抑制p53、p21的表達，HCV治愈后，CD8+T淋巴細胞衰老狀態部分恢復，SIRT1水平下降至與健康對照組無差異，但p53、p21表達水平低。衰老T淋巴細胞的增殖功能被抑制，有促炎的特征并且分泌高濃度的促炎因子，也稱作SASP，其與免疫功能有關[10]。

本研究中HCV組與健康對照組相比，外周CD8+T淋巴細胞上PD-1、Tim-3表達水平上升，經治療后，HCV治愈組表達下降，但是HCV治愈組與HCV組相比無統計學差異。與本研究一致的，DAA治療清除HCV對CD8+T淋巴細胞功能和線粒體損傷恢復作用有限，PD-1和Tim-3在治療前后無統計學差異[11]。使用PD-1/PD-L1阻滯劑和Tim-3阻滯劑后，HCV特異性CD8+T淋巴細胞仍有增殖能力。此前有研究[12]分析了慢性HCV感染者CD4+和CD8+T淋巴細胞的衰竭狀態和促炎因子，發現PD-1在HCV肽刺激的CD4+T淋巴細胞上表達上升，Tim-3在HCV肽刺激的CD8+T淋巴細胞上表達上升。而促炎因子IL-2、TNFα、IL-17A和IL-6在T淋巴細胞培養中顯著下降。研究者認為慢性HCV感染導致CD4+T和CD8+T淋巴細胞功能衰竭，病毒持續感染。而本研究分析了HCV感染者外周血SASP，其中IL-2、CXCL1 GRO在3組人群中均無統計學差異，IL-6、TNFα在HCV治愈組比健康對照組升高，HCV治愈組和HCV組相比稍有下降，其中TNFα有統計學差異。有研究[13]證實慢性丙型肝炎患者血清 IL-6水平均明顯高于健康對照組，在以索磷布韋為基礎的抗HCV治療12周后，慢性丙型肝炎患者血清IL-6水平均較基線明顯降低；升高表達的IL-6 可發揮促進淋巴細胞增殖、拯救衰竭細胞功能的作用[14]。有研究[15]對使用DDA治療4周就獲得持續病毒性應答(SVR)和復發的HCV感染者與基線和治療終點的CD8+T淋巴細胞進行分析，發現PD-1陽性的CD8+T淋巴細胞及細胞毒性能力和獲得早期SVR相關，與本研究一致的是，Tim-3、TNFα在早期獲得SVR的CD8+T淋巴細胞上表達升高。

綜上，本研究分析了HCV感染者DAA治療前后CD8+T淋巴細胞衰老、功能相關指標的變化。發現與健康對照組相比，HCV感染者CD8+T淋巴細胞衰老，HCV組CD8+T淋巴細胞上SIRT1表達水平升高，HCV治愈后，CD8+T淋巴細胞衰老狀態部分恢復，SIRT1水平下降至與健康對照組無差異，p53、p21在HCV組和HCV治愈組表達水平均降低；HCV感染者CD8+T淋巴細胞上PD-1、Tim-3表達水平升高，分泌的IL-6和TNFα表達水平升高。DAA治療后衰老緩解，T淋巴細胞功能部分恢復，HCV治愈組CD8+T細胞PD-1和IL-6、TNFα的水平與健康對照組無統計學差異。