肝硬化患者腸道菌群失調的特征及驅動因子分析

郭曉霞，胡 娜，廉曉曉，孫元培，李玉珍，呂 蕾，葉永安，李小科

1 山西省中醫藥研究院，太原 030012；2 山西中醫藥大學，太原 030024；3 北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700

肝硬化是由一種或多種病因長期或反復作用形成的彌漫性肝損傷，屬慢性進行性肝病的終末期階段。肝硬化的早期發現和有效干預措施仍然是當務之急。近年來研究表明，腸道微生態改變與肝臟疾病的發生發展密切相關[1]，可能促進肝硬化患者病情的進展[2]。有效的干預腸道菌群失衡有利于延緩或阻止肝病的發生發展[3]。ALBI指數是利用臨床指標Alb和TBil通過計算得到的數值[4]，可用于評估肝癌及慢性肝病患者的進展及預后[5-7]。研究[8]表明ALBI評分在預測肝硬化患者的嚴重程度和長期預后方面優于MELD評分。本研究通過分析肝硬化患者腸道菌群結構及功能的變化，探索其在肝硬化病情演變過程中的作用，為肝硬化的預防和治療提供理論依據及思路。

1 資料和方法

1.1 研究對象 選取2017年8月-2019年8月于山西省中醫院肝病科就診的肝硬化患者70例為研究對象，另選取10例健康志愿者為健康對照組。入選標準：(1)所有患者經臨床診斷、形態學診斷及影像學檢查確診均符合肝硬化診斷標準，年齡18～70周歲，根據肝功能ALBI分級標準分為1、2、3級；(2)健康對照組年齡18～70周歲，體格檢查、血尿常規、肝功能、腎功能均在正常范圍內。排除標準：(1)高血壓、糖尿病、肥胖、代謝綜合征及各種胃腸道疾病患者；(2)入組前2周內系統使用過抗生素、微生態制劑及質子泵抑制劑患者；(3)孕期及哺乳期婦女。

1.2 研究方法

1.2.1 糞便菌群檢測 留取受試對象的糞便標本3～5 g，于排便后2 h內收集在密閉的糞便儲存盒內，置-80 ℃冰箱冷凍，統一送至上海派森諾生物科技有限公司，提取糞便樣本總DNA，根據細菌16S rDNAV3-V5區設計引物進行擴增(引物名稱338F/806R，F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，利用Illumina Miseq平臺進行高通量測序；測序結果經過Reads拼接，分類單元(operational taxonomic unit, OTU)聚類，物種注釋，α多樣分析，主成分分析，最終得到樣品物種信息。

1.2.2 CDR、HBCDI、CDIG的計算 CDR=(毛螺菌科+瘤胃菌科+韋榮氏菌科+梭菌科)相對豐度/(擬桿菌科+腸桿菌科)相對豐度[9]。HBCDI =(腸球菌屬+鏈球菌屬+乳桿菌屬)相對豐度/(瘤胃球菌屬+普氏菌屬+擬桿菌屬)相對豐度[10]。本研究以存在顯著差異的菌屬為主體，建立新的評價肝硬化患者腸道菌群失衡度的參數(cirrhosis dysbiosis index of genus, CDIG)[CDIG=(糞球菌屬+梭菌屬)相對豐度/(羅斯氏菌屬+韋榮球菌屬+鏈球菌屬+嗜血桿菌屬)相對豐度]，即特定有益原籍菌屬相對豐度與非原籍有害菌屬比值。

1.2.3 臨床指標的檢測 受試者血液標本在山西省中醫院檢驗科檢測，包括血肌酐(SCr)、ALT、AST、Alb、TBil、PLT、PT、內毒素。

1.2.4 ALBI指數的計算 ALBI分數=0.66×log10[TBil(μmol/L)]-0.085×[Alb(g/L)]。分級標準：1級，ALBI評分≤-2.60；2級，-2.60-1.39[4]。

1.3 倫理學審查 本研究經山西省中醫院倫理委員會審批通過(省中醫倫字：2016-05006)，患者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 本研究共納入70例肝硬化患者，女28例，男42例，年齡(54.38±9.57)歲；病毒性肝硬化50例，酒精性肝硬化6例，原發性膽汁性肝硬化8例，不明原因6例；ALBI 1級31例，2級32例，3級7例。健康對照者10例，女4例，男6例，年齡(46.13±11.68)歲。肝硬化不同級別與健康對照組之間性別、年齡差異均無統計學意義(P值均>0.05)，具有可比性。肝硬化不同級別的患者合并腹水、PLT、ALT、AST、TBil、Alb、PT及內毒素水平比較，差異均具有統計學意義(P值均<0.05)，SCr及肝硬化病因比較，差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2.2 肝硬化組和健康對照組的腸道菌群多樣性改變 從菌群組成來看，本研究發現在門水平上，健康對照組和肝硬化組中，厚壁菌門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門占總腸道菌群的95%以上，其中厚壁菌門占絕對優勢。屬水平上，健康對照組和肝硬化組的腸道微生物組成有明顯不同，雙歧桿菌在兩組中均為優勢菌屬，但與健康對照組相比，肝硬化組雙歧桿菌占比有所下降，鏈球菌屬占比有所上升(表2)。

表2 所有物種的分類學組成(%)

本研究對所有鑒定的細菌操作OTU進行序列對比分析，結果顯示與健康對照組相比，有81個OTU是肝硬化患者腸道菌群宏基因組中特有的，其中ALBI 1級、2級、3級分別獨有39、34、8個OTU(圖1)，這表明肝硬化患者腸道菌群的種類發生了特異性變化。

本研究應用Alpha多樣性反應腸道物種的豐富度和均勻度。Chao1指數、ACE指數反映的是群落的豐富度，Shannon指數、simpson指數反映的是群落的多樣性。Alpha多樣性分析結果表明，相對于健康對照組，肝硬化各組Chao1、ACE指數降低，豐富度明顯減少(P值均<0.05)，Chao1、ACE指數與ALBI分級呈顯著負相關(r值分別為-0.287、-0.297，P值分別為0.016、0.012)；但是多樣性指數(shannon和simpson)并未在健康對照組和肝硬化組間發現差異及相關性(P值均>0.05)(表3)。

表1 研究對象的一般資料

表3 Alpha多樣性指數

表4 各組菌屬相對豐度變化

2.3 肝硬化患者腸道菌群的屬水平分析 為了進一步探明菌群宏基因組變化的原因，本研究對腸道菌群中菌種進行了分析。與健康對照組相比，隨著肝功能ALBI分值增加，羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬和嗜血桿菌屬的相對豐度顯著升高，糞球菌屬和梭菌屬相對豐度明顯下降，差異均具有統計學意義(P值均<0.05)(表4)。將差異菌屬進行相關性分析，結果發現有益菌糞球菌屬與梭菌屬之間呈正相關(P<0.05)，致病菌羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬、嗜血桿菌屬四者之間彼此呈正相關(P值均<0.001)，有益菌糞球菌屬與致病菌羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬之間呈顯著負相關(P值均<0.001)(圖2)。

2.4 肝硬化差異菌屬與臨床指標的相關性 將差異菌屬與臨床指標進行相關性分析，如表5所示，糞球菌屬與Alb呈正相關，與PT、ALBI評分呈負相關(P值均<0.05)；羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬、嗜血桿菌屬均與Alb呈負相關，與PT、TBil、ALBI評分呈正相關(P值均<0.05)。

為了更好的探究肝硬化腸道菌群結構與臨床指標的內在聯系，本研究利用CANOCO5.0軟件進行RDA分析。如圖3所示，菌群分布與臨床指標之間的關系較復雜，利用BioEnv分析表明ALT、AST、Alb、PT、TBil、EXT、ALBI這7個指標是影響腸道細菌群落變異的主要臨床指標組。根據箭頭長度可以看出PT、TBil、AST與腸道菌群分布相關性較大，PT、AST、TBil作為單因子對群落變異的解釋度分別是15.5%、5.1%、4.7%，其中PT對群落變異的影響最具有顯著性(P=0.002)，可以認為PT是驅動腸道群落變異的主要因子。

2.5 肝硬化患者腸道菌群失衡度與肝病嚴重程度的相關性 對各組進行肝硬化菌群失衡度的計算，結果顯示健康對照組、ALBI 1級、ALBI 2級、ALBI 3級的CDR、HBCDI差異均無統計學意義(P值均>0.05)。健康對照組、ALBI 1級、ALBI 2級、ALBI 3級的CDIG差異具有統計學意義(P<0.001)(表6)。

將腸道菌群失衡指標CDIG與臨床指標進行相關性分析，結果顯示CDIG與TBil、PT及ALBI呈顯著負相關(r值分別為-0.313、-0.323、-0.366,P值分別為0.008、0.006、0.002)，與Alb呈顯著正相關(r=0.331,P=0.005)。

3 討論

腸道菌群是微生物群的重要組成部分，維持著腸黏膜的完整性及通透性，它們的相對豐度變化可以改變生理平衡，導致腸內外疾病的發生。腸道微生物已被證明參與誘導和促進早期肝病中的肝損傷[11]。腸道菌群失調導致腸道屏障功能受損，腸道通透性增加，內毒素穿過腸黏膜進入血循環，血漿內毒素升高，形成內毒素血癥。腸屏障功能的破壞與內毒素血癥互為因果，形成惡性循環，導致肝損傷加重[12-14]。血漿內毒素水平升高的程度, 可反映出腸黏膜屏障損傷的程度[15]，及作為臨床監測肝硬化疾病進程的重要指標。因此針對腸道菌群失衡對肝硬化進行早期檢測和干預，在減慢或逆轉肝硬化進展方面具有不可忽視的作用。

本研究對健康人和肝硬化患者糞便樣本中微生物的多樣性進行了初步分析, 發現隨著肝硬化疾病發展，腸道菌群多樣性逐漸降低，且與疾病病程呈明顯負相關，表明肝硬化程度越重，腸道菌群多樣性降低愈明顯。健康人和肝硬化患者糞便中優勢菌群以厚壁菌門和放線菌門為主；但具體到屬的水平上則出現較大的個體差異性。與健康人群相比，同一種主導菌群雙歧桿菌屬在肝硬化組比例降低。雙歧桿菌屬可調節機體免疫，增加抗炎及抗感染能力[16]，越來越多的證據[17-18]顯示肝硬化患者糞便中雙歧桿菌總數減少。OTU分析顯示有81個OTU是肝硬化患者腸道菌群宏基因組中特有的，這表明肝硬化患者腸道菌群的種類發生了特異性變化。本研究發現健康人群與肝硬化組的糞便菌群存在顯著差異，肝硬化組有2種菌屬含量明顯減少，分別是增加腸道抗炎功能的梭菌屬和維持腸道完整性的糞球菌屬。糞球菌屬和梭菌屬的減少有可能是肝硬化患者腸道黏膜屏障損傷的主要原因。與文獻報道[4,19]有所不同的是，本研究發現肝硬化患者尤以羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬和嗜血桿菌屬4種潛在致病菌增多為特征，且彼此之間呈明顯正相關。韋榮球菌屬、鏈球菌屬和嗜血桿菌屬菌屬為人類口腔的3大定植菌，是重要的條件致病菌[20]，沿著消化道異位定植到腸道后發揮協同作用，導致肝硬化病情加重。肝硬化與口腔微生物群之間的聯系已經得到證實[21]。值得注意的是本研究發現產丁酸的羅斯氏菌屬在肝硬化患者顯著富集，且與韋榮球菌屬、鏈球菌屬和嗜血桿菌屬呈明顯正相關，相關研究[22]中也曾發現類似現象，可見羅斯氏菌屬豐度增加是與疾病進展相伴隨的。物種間的菌株差異決定了羅斯氏菌屬在肝硬化的發展中是致病菌或益生菌，還是作為一種代償性機制參與疾病的過程還有待進一步研究。

表5 差異菌屬與臨床指標的相關性分析

表6 肝硬化患者不同腸道菌群失衡指標的比較

ALBI評分反應肝硬化嚴重程度，從肝硬化整個病程來看，羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬和嗜血桿菌屬與肝硬化嚴重程度呈正相關，糞球菌屬與肝硬化嚴重程度呈負相關，梭菌屬與肝硬化嚴重程度之間無明顯相關性，與國內外研究結果具有部分一致性[23-24]。故本研究認為梭菌屬作為次要因素，對肝硬化病情影響較小。肝硬化患者血漿內毒素水平明顯高于健康組，且隨著肝病嚴重程度而漸升高，但與差異菌屬均無明顯相關性，說明本研究中的差異菌屬并不能反映內毒素水平的變化，對腸道屏障功能可能無調節作用，而參與內毒素調節也許存在特定的條件致病菌[25-26]，提示腸通透性增加并不是導致肝硬化患者發生腸道菌群失調的決定性因素。與臨床指標的相關性分析中發現羅斯氏菌屬、韋榮球菌屬、鏈球菌屬、嗜血桿菌屬與Alb呈負相關而與PT、TBil呈正相關，糞球菌屬與Alb呈正相關而與PT呈負相關，因此通過調節腸道菌群可以改善肝硬化患者的臨床生化指標[27]。對肝硬化患者的腸道菌群中的差異菌群與臨床指標進行RDA分析，結果顯示PT、TBil、AST與腸道菌群分布相關性較大，其中PT對群落變異的影響最具有顯著性，可以認為PT是驅動腸道群落變異的主要因子。PT是反映肝臟合成、病變嚴重程度及預后的重要指標[28-29]。PT延長表明肝硬化程度加重，胃腸道淤血和組織水腫明顯，腸腔內環境改變而發生腸道菌群變異。

本研究初步探討了菌群失衡與肝硬化嚴重程度的關系，結果提示菌群失衡的嚴重程度和肝功能ALBI分級程度有關。ALBI分級程度越高，腸道菌群失衡越嚴重。因此定量評價腸道菌群失衡程度有助于分析菌群失衡與肝病的相關性。作者選取肝硬化不同ALBI分級間差異菌屬中非原籍有害菌屬為分母，有益原籍菌屬為分子來構建CDIG參數。該參數反映的是個體有益原籍菌群與非原籍有害菌群的偏離度，數值越小，菌群失調程度越重。結果顯示CDIG參數在肝硬化不同ALBI分級間存在顯著差異。肝硬化病情越重，CDIG越小，肝硬化患者腸道菌群失衡越嚴重。其中ALBI 3級患者的菌群失衡度是ALBI 2級和1級患者的6和19倍，表明腸道菌群失衡在終末期肝硬化患者中尤為明顯，腸道菌群失調可能促進肝功能惡化。CDIG與TBil、PT及ALBI指數呈顯著負相關，與Alb呈顯著正相關，因此CDIG可在一定程度上反映肝病的嚴重程度及肝硬化病情的進展。既往研究中定量評價腸道菌群失衡程度的指標如CDR[9]和HBCDI[10]在本研究肝硬化不同ALBI分級間差異均無統計學意義，提示CDR和HBCDI在本研究人群中評價腸道菌群失衡的效能不佳。考慮與本研究群體包括多種病因引起的肝硬化有關，具體到不同病因的肝硬化是否適用CDIG還應進一步擴大樣本量進行研究。

本研究在證實肝硬化與腸道菌群有密切關系的基礎上，進一步觀察了肝硬化的發展及演變過程中腸道菌群結構的改變。肝硬化腸道菌群中關鍵菌屬的存在并不能保證其對菌群的影響，還有臨床指標中的PT來決定關鍵菌群的分布和效應。但本研究也存在不足之處，肝硬化不同ALBI間差異菌屬雖然被鑒別為關鍵物種，但并不代表他們所包含的菌種都對肝硬化的腸道群落結構和功能產生影響，還有待更加深入全面的研究。

綜上所述，肝硬化患者存在菌群失調的主要特征為致病菌的過度增長協同有益菌的缺乏及各菌屬之間的比例失調。腸道菌群是肝硬化發生發展和疾病控制的重要環節，通過菌群移位和內毒素加重炎癥反應，促進肝硬化疾病的病理過程，并對疾病活動產生影響，從而影響肝硬化預后。本研究所建立的CDIG可評估肝硬化患者腸道菌群失衡狀態及進展風險，為肝硬化的治療提供新的作用方向和靶點。