茵陳草水提物對四氯化碳致大鼠肝纖維化的干預(yù)作用

邵敏敏 毛 毛 梁 韜

茵陳草（Artemisia dracunculus L.）為菊科多年生叢生型芳香草本植物，別名白蒿，性微寒、味苦辛，具有清濕熱、退黃疽，保肝利膽的作用[1]。民間主要用于保肝利膽、肝纖維化的治療[2]。但其對抗肝纖維化的作用機(jī)制鮮見報道。本研究基于前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，采用四氯化碳誘導(dǎo)建立肝纖維化大鼠模型，探究茵陳草水提物對肝纖維化大鼠的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動 物 SD 大鼠，SPF 級，雌雄各半，體質(zhì)量（180～220）g，浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證∶SYXK（浙）2018-0016，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證∶SCXK（浙）2018-0006。大鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫18～25℃，相對濕度40%～70%，12h 光照晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)開始前大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。

1.2 藥 物 茵陳草水提物制備∶茵陳草4kg 干燥粗粉，加入40L 蒸餾水90℃下加熱回流提取2h，紗布過濾，濾渣繼續(xù)加入40L 蒸餾水90℃下加熱回流提取2h，連續(xù)水煮3 次，紗布過濾后，將每次的濾液合并，然后采用微波真空干燥器濃縮至2L 濃縮液，茵陳草水提物的濃度（含生藥量）∶2g/mL。

1.3 試 劑 四氯化碳（分析純）∶成都市科隆化工試劑廠，批號20 170926；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）試劑盒，批號20190517、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒，批號20190606，南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒，批號190718，白介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒，批號190525，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；水飛薊素膠囊∶德國馬博士大藥廠，批號B180156。透明質(zhì)酸（HA）試劑盒，批號 190324；III 型前膠原（PCIII）試劑盒，批號 190314；層粘連蛋白（LN）試劑盒，批號 190405；IV 型膠原（IV-C）試劑盒，批號190329，均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要儀器 9602A-酶標(biāo)儀（北京艾普生設(shè)備有限公司）；UVmini-1240 型紫外-可見分光光度（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；TGL-16G 高速臺式冷凍離心機(jī)（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠肝纖維化模型建立[3]將70 只SD 大鼠隨機(jī)抽取10 只為正常組。其余大鼠腹腔注射四氯化碳與花生油混合溶液（1:1）1mL/kg，每周注射2 次，連續(xù)注射8 周。末次注射1 天后，抽取10 只大鼠，對其肝臟進(jìn)行Masson 染色，觀察其病理學(xué)變化，確認(rèn)大鼠肝纖維化造模成功。

2.2 分組及給藥 使用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)將50 只肝纖維化模型大鼠分為模型組、陽性藥水飛薊素40mg/kg 組[4-5]、茵陳草水提物2.5、5、10g/kg 劑量組，每組10 只。灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)給藥56 天。模型組、正常組大鼠每天灌胃等體積生理鹽水。

2.3 HE 染色方法 石蠟切片（厚度3μm）在二甲苯中脫蠟10min，移入二甲苯與純酒精（1:1）的混合液中5min，用酒精按常規(guī)逐級脫水，蘇木精染液染色10min，水洗玻片上多余的染液，0.5%鹽酸酒精分色，蒸餾流水沖洗15min 后蒸餾水短洗，0.5%伊紅染液染色5min，酒精常規(guī)逐級脫水，二甲苯透明，封片。

2.4 Masson 染色法 石蠟切片在二甲苯中脫蠟10min，移入二甲苯與純酒精（1:1）的混合液中5min，用酒精按常規(guī)逐級脫水，蘇木精染液染色10min，水洗玻片上多余的染液，0.5%鹽酸酒精分色，蒸餾流水沖洗15min 后蒸餾水短洗，用Masson 麗春紅酸性復(fù)紅液10min，以2%冰醋酸水溶液浸洗片刻，1%磷鎢酸水溶液分化5min，不經(jīng)水洗,直接用苯胺藍(lán)液染5min。以0.2%冰醋酸水溶液浸洗片刻。95%酒精、無水酒精、二甲苯透明、中性樹膠封固。

2.5 指標(biāo)檢測 末次給藥4h 后，3%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，腹主動脈取血，離心提取血清。剝離肝臟，切取部分放置于10%福爾馬林溶液固定，包埋切片，HE 染色及Masson 染色觀察大鼠肝臟的病理學(xué)變化和纖維化程度。比色法檢測大鼠血清AST、ALT 含量，ELISA 法檢測TNF-α、IL-1β 表達(dá)量。比色法檢測肝臟透明質(zhì)酸（HA），III 型前膠原（PCIII），層粘連蛋白（LN）、IV 型膠原（IV-C）含量。

2.6 肝臟纖維化程度分級 根據(jù)全國肝病會議（西安）通過的標(biāo)準(zhǔn)[6]，將肝臟纖維化病變程度分為5 個級別∶S0∶無肝臟纖維化病變；S1∶肝臟匯管區(qū)纖維化擴(kuò)大，限局竇周及小葉內(nèi)纖維化；S2∶肝臟匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構(gòu)保留；S3∶肝臟纖維間隔伴小葉結(jié)構(gòu)紊亂，無肝硬化；S4∶出現(xiàn)早期肝硬化。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化和纖維化程度 HE染色以及Masson 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)血管壁清晰，未見有膠原纖維。模型組大鼠肝細(xì)胞排列紊亂，有明顯壞死及大量膠原纖維出現(xiàn)。水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組肝細(xì)胞排列相對有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)有所恢復(fù)，膠原纖維均有所減少。見插頁圖1-2。

3.2 各組大鼠肝組織纖維化程度比較 各組大鼠肝組織病理分級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

3.3 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組血清ALT、AST 水平降低（P 均＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠肝組織纖維化程度比較（例）

表2 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

表2 各組大鼠血清ALT、AST 水平比較（U/mL，）

注∶正常組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝纖維化模型大鼠，予生理鹽水；水飛薊素組為肝纖維化模型大鼠予40mg/kg 水飛薊素混懸液；茵陳草水提物高劑量組為肝纖維化模型大鼠予10g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物中劑量組為肝纖維化模型大鼠予5g/kg茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物低劑量組為肝纖維化模型大鼠予2.5g/kg 茵陳草水提物混懸液；ALT 為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；ALT 為天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊素組比較，cP＜0.05；與茵陳草水提物高劑量組比較，dP＜0.05

3.4 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 表達(dá)量比較與正常組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組肝組織TNF-α、IL-1β 含量下降（P 均＜0.05）。見表3。

3.5 各組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 水平比較與正常組比較，模型組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 含量顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，水飛薊素、茵陳草水提物各劑量組肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 含量下降（P 均＜0.05）。見表4。

4 討論

肝纖維化是各種致病因子造成肝臟受損后，肝組織在修復(fù)過程中代償反應(yīng)而形成肝內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理生理過程，是各種慢性肝病向肝硬化、肝功能衰竭等肝臟疾病發(fā)展所共有的病理變化和必經(jīng)之路[7]。ALT、AST 是衡量肝臟代謝功能重要的酶，當(dāng)肝臟出現(xiàn)受損、壞死時，ALT、AST 會從肝細(xì)胞內(nèi)溢出而進(jìn)入到血液中，致血液中ALT、AST 含量升高[8]。本研究結(jié)果表明，茵陳草水提物干預(yù)后大鼠血清ALT、AST 的含量明顯下降，提示大鼠的肝臟代謝功能有所恢復(fù)。HE 染色結(jié)果表明，茵陳草水提物干預(yù)后肝臟炎癥細(xì)胞浸潤減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)較完整，排列相對整齊。這與大鼠肝臟代謝功能有所恢復(fù)的結(jié)果相一致。

表3 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 表達(dá)量比較（pg/mL，）

表3 各組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β 表達(dá)量比較（pg/mL，）

注∶正常組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝纖維化模型大鼠，予生理鹽水；水飛薊素組為肝纖維化模型大鼠予40mg/kg 水飛薊素混懸液；茵陳草水提物高劑量組為肝纖維化模型大鼠予10g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物中劑量組為肝纖維化模型大鼠予5g/kg茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物低劑量組為肝纖維化模型大鼠予2.5g/kg 茵陳草水提物混懸液；TNF-α 為腫瘤壞死因子-α；IL-1β為白介素-1β；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊素組比較，cP＜0.05；與茵陳草水提物高劑量組比較，dP＜0.05

肝損傷是肝纖維化發(fā)生的始動因素，而肝纖維化是肝炎發(fā)展為肝硬化的中心環(huán)節(jié)[9]。受損的肝細(xì)胞通常會釋放多種炎癥因子，肝星狀細(xì)胞受炎癥因子刺激后釋放大量的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），導(dǎo)致大量膠原因子活化及沉積，造成肝纖維化形成[10]。ECM 在肝臟中的平衡與降解是一個動態(tài)的過程，這一過程對肝纖維化的形成起著關(guān)鍵的作用，而對肝纖維化指標(biāo)的檢測可直觀的體現(xiàn)這一動態(tài)過程[11]。HA、LN 的活化為肝星狀細(xì)胞受炎癥因子刺激后而大量形成，其生產(chǎn)的速度遠(yuǎn)大于機(jī)體對HA 的清除速度時，造成HA、LN 在肝臟中的堆積[12-13]。PCIII、IV-C 含量與肝纖維化程度密切相關(guān)，能夠反映其合成狀況，也是炎癥活動性指標(biāo)[14-15]。本研究結(jié)果表明，茵陳草水提物干預(yù)后大鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-1β 和膠原因子HA、PCIII、LN、IV-C 含量顯著下降，表明茵陳草水提物可下調(diào)肝臟中炎癥因子和膠原因子的含量，這與Masson 染色結(jié)果中茵陳草水提物干預(yù)組的膠原纖維減少相一致。本研究結(jié)果還顯示，隨著茵陳草水提物給藥劑量的加大，TNF-α、IL-1β、HA、PCIII、LN、IV-C 含量下降幅度也隨著增大，表明劑量與各指標(biāo)的值存在一定的線性關(guān)系。

表4 各組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 水平比較（μg/L，）

表4 各組大鼠肝組織HA、PCIII、LN、IV-C 水平比較（μg/L，）

注∶正常組為健康大鼠，予生理鹽水；模型組為肝纖維化模型大鼠，予生理鹽水；水飛薊素組為肝纖維化模型大鼠予40mg/kg 水飛薊素混懸液；茵陳草水提物高劑量組為肝纖維化模型大鼠予10g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物中劑量組為肝纖維化模型大鼠予5g/kg 茵陳草水提物混懸液；茵陳草水提物低劑量組為肝纖維化模型大鼠予2.5g/kg 茵陳草水提物混懸液；HA 為透明質(zhì)酸；PCIII 為III 型前膠原；LN 為層粘連蛋白；IV-C 為IV 型膠原；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與水飛薊素組比較，cP＜0.05；與茵陳草水提物高劑量組比較，dP＜0.05

總之，茵陳草水提物能使纖維化大鼠肝功能和病理損傷得到明顯的改善，其作用機(jī)制可能為通過減少肝纖維化大鼠中膠原因子HA、PCIII、LN、IV-C的含量，減少膠原纖維的形成，同時減少炎癥因子TNF-α、IL-1β 的含量，緩解肝組織炎癥損傷，從而達(dá)到對纖維化模型大鼠肝組織纖維化改善作用。