芹菜素對大鼠燒傷創面微循環改善作用的研究

戴如冰 陳 驊 凌書建

燒傷是一種因熱力，如火、熱氣、熱液體等所致的人體組織器官損傷，發病率居外傷疾病譜第四位，具有非常高的致死率及致殘、致畸率，給家庭和社會造成危害[1]。皮膚是燒傷最易損傷的組織，根據組織病變，皮膚創面可分為凝固區、瘀滯區和充血區三個區帶[2]，而微血栓形成及局部水腫所致瘀滯區組織進行性壞死將導致創面加深[3]，從而增加治療難度并影響治療預后。所以改善創面組織微循環、挽救瘀滯區組織細胞，是提高燒傷預后的關鍵。既往研究發現，黃酮類化合物具有改善局部微循環的作用[4-5]。芹菜素是天然存在的一種具有多種生物學活性的黃酮類化合物。本實驗以深II 度燒傷大鼠模型為研究對象，研究芹菜素對大鼠燒傷創面微循環的影響并探索其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 180 只無病原微生物級（SPF 級）雄性Wistar 大鼠，8 周齡，體質量（220～250）g，由河北省實驗動物中心提供[許可證號∶SCXK（冀）2018-004]；清潔級環境分籠飼養，飼養條件∶12h 光照黑暗交替、溫度（25±1）℃、相對濕度（60±5）%，自由飲水進食，1 周后開展實驗。所有大鼠進行編碼后按照隨機數字表法隨機分為假燒傷組，模型組，磺胺嘧啶銀軟膏單藥組，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組（12.5、25、50mg/kg），各30 只。本實驗通過中國人民武裝警察部隊海警總隊醫院倫理委員會審核，倫理批件號∶HJLL[K]字2019-026，實驗過程嚴格按照倫理審批通過的方案執行。

1.2 藥物與試劑 芹菜素購自陜西慧科植物開發有限公司（批號190524，純度≥98%）；磺胺嘧啶銀軟膏購自沈陽紅旗制藥有限公司（規格∶1%，批號181225）；乳酸鈉林格注射液購自安徽雙鶴藥業有限公司（批號20190426）；兔抗鼠表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞因子（bFGF）、血管內皮生長因子（VEGF）、β-actin 單克隆抗體購自上海碧云天生物技術有限公司（批號201904015、201905027、201905009、20190514）；ECL 超敏化學發光液購自美國Thermo Fisher Scientific 公司（批號EB190217）。

1.3 主要儀器 YLS-5Q 型燙傷儀（天津科技發展有限公司）；LISCA 型激光多普勒血液灌流成像儀（瑞典Perimed 公司）；Allegra 21R 型低溫離心機（美國Beckman 公司）；CUT 4050 型旋轉切片機（德國Leica 公司）；Tetra Systerm 型垂直電泳槽、Power Pac Basic 轉膜槽（美國Bio-Rad 公司）；CKX41 型倒置光學顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 實驗方法

2.1 藥物制備 磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組，芹菜素給藥劑量分別為12.5、25、50mg/kg，為了保持注射給藥體積一致，均為2mL/kg，將芹菜素配制成濃度為6.25、12.5、25mg/mL 的溶液。

2.2 模型制備與給藥 參照鄭國鈺等[6]報道的實驗方法制備深II 度燒傷大鼠模型。各組大鼠禁食禁水12h 后，腹腔注射水合氯醛溶液（濃度10%，劑量0.3mL/100g）實施麻醉，剃除背部毛發后用8%的Na2S 溶液脫毛，溫水沖洗并用75%乙醇消毒，假燒傷組立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5mL 抗休克；其余各組大鼠均采用燙傷儀制備深II 度燒傷大鼠模型，參數設置為∶壓力0.03MPa、溫度106℃持續時間5s，通過病理切片證實造模成功（病理切片呈現∶部分真皮層內細胞壞死，部分毛囊等附件殘存，毛細血管擴張、管腔可見紅細胞及血液瘀滯）（見插頁圖1）。造模完成后各組大鼠立即腹腔注射乳酸鈉林格溶液5mL抗休克。假燒傷組和模型組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg，每天1 次；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組于燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏，每2 天換藥1 次，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg，每天1 次；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組于燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏，每2 天換藥1 次，并分別腹腔注射濃度為6.25、12.5、25mg/mL 的芹菜素溶液2mL/kg，每天1次；療程14 天。

2.3 創面大體情況觀察及創面組織病理學檢查 治療14 天后觀察各組大鼠燒傷創面狀況，包括皮膚顏色、結痂狀況、分泌物、愈合狀況等；各組分別隨機取10 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創面皮膚組織，置4%多聚甲醛溶液72h 實施固定，經梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片（厚度5μm）后行HE 染色、梯度酒精脫蠟、二甲苯透明后中性樹脂封片，然后通過光學顯微鏡觀察。

2.4 創面愈合率計算 各組分別隨機取10 只大鼠，分別于給藥第0、14 天燒傷創面拍照，計算創面面積，創面愈合率（%）=（1-未愈創面面積/初始創面面積）×100%。

2.5 創面組織微循環血流灌注值（MPD）測定[7]取2.4 步驟的10 只大鼠，恒溫25℃環境下，通過激光多普勒血液灌流成像儀測定創面組織MPD 值，儀器參數設置∶掃描速度100ms/Line、掃描寬度64 像素、輪廓50 像素、視距12cm、顯示頻率5Hz，每只大鼠掃描5 次（掃描間隔為5s）取平均值。

2.6 創面組織微血管密度（MVD）測定[8]取2.3 步驟制備的創面組織HE 染色病理切片，在200 倍倒置光學顯微鏡下，每張切片于微血管豐富處選取互不重疊的5 個視野計數微血管數量，然后分別取平均值。

2.7 創面組織含水量測定 取2.5 步驟的10 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創面皮膚組織，沖洗干凈后稱重（W1），置80℃烤箱烘烤24h 至恒重后稱量（W2），含水量（%）=[（W1-W2）/W1]×100%。

2.8 創面組織EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達量測定各組分別取剩余的10 只大鼠，麻醉后頸椎脫臼致死，切取創面皮膚組織，于冰上剪碎后，加入9 倍量冷裂解液行研磨勻漿，恒4℃離心（12000rpm，15min）取上清，BCA 法測定總蛋白含量后，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕法轉PVDF 膜、5%脫脂奶粉37℃封閉1h，滴加兔抗鼠EGF、bFGF、VEGF 單抗（稀釋倍數1:3000）和兔抗鼠β-actin 單抗（稀釋倍數1:1000）后4℃孵育12h，洗膜后滴加山羊抗兔IgG 二抗（稀釋倍數1:500，37℃振蕩孵育1h，PBS 洗膜后滴加ECL 顯色發光，運用凝膠成像系統獲得條帶；以β-actin 為內參，以條帶灰度值對目標檢測蛋白進行半定量分析。

2.9 統計學方法 應用SPSS 17.0 統計軟件，實驗數據以均數±標準差（） 表示，行方差齊性檢驗，方差齊分組均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較行t 檢驗，方差不齊采用Tamhane's t2檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面大體情況的影響 給藥治療14 天后觀察發現，假燒傷組大鼠創面毛發生長茂盛，毛發長度已基本恢復；模型組創面新生肉芽較少、結痂厚度不均勻，部分基底仍有黃色液體滲出；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組創面縮小、大部分痂下愈合，無滲出；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組創面呈不同程度縮小、大部分痂下愈合，無滲出，新愈合皮膚紅潤，毛發開始生長，其中磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素高劑量組效果最為顯著。

3.2 芹菜素對深II 度燒傷大鼠組織病理性形態結構變化的影響 給藥治療14 天后行HE 染色發現，假燒傷組未見明顯異常，模型組可見壞死組織以及炎性細胞浸潤，出現較薄的新生上皮組織；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組上皮組織成熟較好、排列整齊，汗腺、皮脂腺等結構較為完整但仍較表淺；其中磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素高劑量組可見表皮生成，上述效果相對最好。見插頁圖2。

3.3 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面愈合率的影響磺胺嘧啶銀軟膏組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組愈合率均升高，與模型組比較，差異均有統計學意義（P 均＜0.01）；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組愈合率顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見表1。

3.4 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面MPD、MVD 的影響 模型組MPD、MVD 較假燒傷組顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，磺胺嘧啶銀軟膏單藥組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組MPD、MVD 均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組MPD、MVD 顯著增加（P＜0.01）。見表2。

表1 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面愈合率的影響（%，）

表1 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面愈合率的影響（%，）

注∶假燒傷組、模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并分別腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 濃度的芹菜素溶液2mL/kg；與模型組比較，aP＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01

3.5 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面組織含水量的影響 模型組創面組織含水量較假燒傷組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組含水量顯著降低（P＜0.01）；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素高劑量組含水量較磺胺嘧啶銀軟膏單藥組顯著降低（P＜0.05）。見表2。

3.6 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面組織EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達的影響 與假燒傷組比較，模型組、磺胺嘧啶銀軟膏單藥組和磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達量均顯著上調（P＜0.05 或P＜0.01）；與模型組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組EGF、bFGF、VEGF 表達量顯著上調（P＜0.05 或P＜0.01）；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素中、高劑量組EGF、bFGF、VEGF 表達量較磺胺嘧啶銀軟膏單藥組顯著上調（P 均＜0.01）。見表3、插頁圖3。

4 討論

燒傷后創面微循環障礙是導致創面加深、遷延不愈而影響預后的重要原因，所以改善局部微循環對燒傷創面治療意義重大。胡澤華等[8]、林建昌等[9]、馮智才等[10]研究發現，通過藥物干預改善燒傷創面微循環對創面愈合具有促進作用。既往研究發現，芹菜素能夠通過上調VEGF 表達以促進血管新生以及改善血流動力學、血液流變學、調節血脂等而改善局部微循環[11-13]。

表2 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面MPD、MVD 和含水量的影響（）

表2 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面MPD、MVD 和含水量的影響（）

注∶假燒傷組、模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并分別腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 濃度的芹菜素溶液2mL/kg；MPD 為微循環血流灌注值；MVD 為微血管密度；與假燒傷組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，cP＜0.05，ccP＜0.01

表3 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面組織EGF、VEGF、bFGF 蛋白表達的影響（）

表3 芹菜素對深II 度燒傷大鼠創面組織EGF、VEGF、bFGF 蛋白表達的影響（）

注∶假燒傷組、模型組予腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏單藥組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并腹腔注射0.9%氯化鈉溶液2mL/kg；磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素低、中、高劑量組予燒傷皮膚涂抹磺胺嘧啶銀軟膏并分別腹腔注射6.25、12.5、25mg/mL 濃度的芹菜素溶液2mL/kg；EGF 為表皮生長因子；VEGF 為血管內皮生長因子；bFGF 為堿性成纖維細胞因子；與假燒傷組比較，aP＜0.05，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，bbP＜0.01；與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，cP＜0.01

按照“三度四分法”分級，根據燒傷深度可分為I度、淺II 度、深II 度和III 度燒傷，其中深II 度燒傷臨床最為常見。因此，本研究采用壓力0.03MPa、106℃持續5s 的方法制備深II 度燒傷大鼠模型，結合外用磺胺嘧啶銀軟膏，探討芹菜素對燒傷創面微循環及創面愈合的影響[14]。結果顯示，與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素治療能夠顯著改善創面愈合狀況、抑制創面組織病變、提高創面愈合率，能夠提高創面組織MPD、MVD 并降低創面組織含水量，提示芹菜素能夠改善大鼠深II 度燒傷創面局部微循環并促進創面愈合。

在燒傷創面愈合的過程中，多種生長因子促進細胞增殖與分化、合成與分泌創面愈合所需物質而發揮重要作用[15]。EGF 能夠促進表皮角質細胞、纖維細胞增殖并促進血管新生和核酸蛋白質合成[16]；bFGF 則能夠促進細胞增殖、分化和遷移，并促進表面上皮組織生成[17]；VEGF 特異性作用于血管內皮細胞有絲分裂原，具有較強的促血管新生作用[18]。本研究發現，與磺胺嘧啶銀軟膏單藥組比較，磺胺嘧啶銀軟膏+芹菜素治療能夠顯著上調創面組織EGF、bFGF、VEGF 蛋白表達，這可能是芹菜素促進大鼠深II 度燒傷創面血管新生進而改善創面微循環的重要機制。

綜上所述，芹菜素能夠通過改善局部微循環而促進大鼠深II 度燒傷創面愈合，其機制可能與調節相關生長因子表達而促進血管新生有關。