桃紅四物湯促進自噬抑制氧糖剝奪誘導心肌細胞凋亡的實驗研究

鄭 祥 王 審

心肌缺血損傷是冠心病主要病理表現，臨床上常用硝酸酯類、β 受體阻滯劑及他汀類藥物治療冠心病，但長期使用會導致嚴重副作用[1]。桃紅四物湯（TST）廣泛應用于高血壓、心絞痛等心血管疾病治療[2]。臨床研究表明，桃紅四物湯可減輕冠心病臨床癥狀，提高患者生活質量[3]。減小腦缺血損傷梗死面積，發揮保護作用[4]。心肌缺血性損傷導致心肌細胞凋亡，抑制凋亡顯著改善心血管疾病癥狀[5]。自噬通過降解受損蛋白質或冗余細胞器維持細胞穩態，介導細胞凋亡過程，與心血管疾病病理過程有關[6-7]。缺血條件下激活心肌細胞自噬，可減輕缺血損傷[3]。研究發現，桃紅四物湯成分當歸可激活自噬[8]。本研究探討桃紅四物湯對心肌缺血的保護作用及其機制，報道如下。

1 實驗材料

1.1 細 胞 H9C2 心肌細胞（ATCC，#FS-0056），購自上海研生生化試劑有限公司。

1.2 動 物 實驗清潔級健康雄性SD 大鼠12 只，體質量（220±20）g，浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號∶SYXK（浙）2018-0012，動物倫理審批號2018111，動物飼養及實驗操作嚴格遵守實驗動物的使用和管理原則。

1.3 試 劑 抗體∶微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ/3Ⅰ（LC3-Ⅱ/Ⅰ，批號12741）、核孔糖蛋白62（p62，批號16177）、B-細胞淋巴瘤因子2 相關X 蛋白（Bax，批號2772）、B-細胞淋巴瘤因子2（Bcl-2，批號15071）和甘油醛酸3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號5174）抗體，購自美國Cell Signaling Technology 公司；試劑∶四唑鹽（MTT）試劑盒（InvitrogenTM，批號V13154），Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒（InvitrogenTM，批號V13242），PVDF 膜（InvitrogenTM，批號IB401002），購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

2 實驗方法

2.1 TST 制備 TST∶桃仁、紅花、熟地黃、當歸、川芎、白芍（購自北京同仁堂浙江中藥材有限公司）各15g，加水450mL（按每克生藥加水5mL），浸泡2h，煮沸后文火慢煎40min，趁熱過濾濾液，自然滴盡，二煎加水270mL，按每克生藥加水3mL，煮沸后，文火慢煎40min，趁熱過濾濾液，自然滴盡，合并濾液，95℃水浴濃縮至90mL，濃度為1mg/mL。

2.2 TST 含藥血清制備 12 只SD 大鼠按照隨機數字表法分為空白血清制備組和TST 含藥血清制備組，每組6 只。含藥血清制備組大鼠每日按體質量給予TST 水煎液10mL/kg 灌胃，含生藥劑量為10g·kg-1·d-1，早晚各灌胃1 次，連續5 天，末次給藥前12h 禁食，不禁水，末次給藥60min 后，水合氯醛腹腔麻醉，從心臟無菌采血。采集的大鼠全血于4℃靜置30min后，低溫離心機1500rpm/min 離心5min，分離的血清用0.45μm 的微孔濾膜過濾除菌，經56℃恒溫水浴、30min 滅活處理后，置于-20℃冰箱備用。空白血清制備組大鼠每只灌胃蒸餾水2mL，其余方法同上。

2.3 心肌細胞氧糖剝奪（OGD）模型制備及分組處理OGD 模型模擬心肌梗死的體內條件，制備方法參照文獻[9]，大致過程∶細胞融合達到80%～90%后將細胞培養液轉化為無血清、無糖的DMEM，在95%N2、5% CO2飽和的缺氧室中37℃孵育4h。對照組細胞用含10% FBS 的高糖DMEM 培養。將OGD 處理后的細胞采用隨機數字表法分為∶對照組、OGD 模型組、OGD+TST 含藥血清組、OGD+TST 含藥血清+雷帕霉素組、OGD+TST 含藥血清+氯喹組。OGD+TST含藥血清組∶用TST 含藥血清處理24h；TST 含藥血清+雷帕霉素組∶用TST 含藥血清和25nM 雷帕霉素處理24h；TST 含藥血清+氯喹組∶用TST 含藥血清和10μM 氯喹處理24h。

2.4 MTT 法檢測心肌細胞活力 H9C2 心肌細胞按4×104密度接種于12 孔板中，分組處理后，每孔加入100μL MTT 原液（5mg/mL），37℃孵育30min。然后每孔加入300μL 二甲基亞砜，平板輕輕搖動10min，在550nm 分光光度計微平板閱讀器上讀取OD 值。用光密度作為細胞存活率的指標，以對照培養基中培養的細胞的光密度歸一化，統計各組細胞存活情況。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 采用Annexin VFITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率。105個細胞懸浮于緩沖液中，進行Annexin V-FITC 和PI 染色，黑暗中室溫下孵育1h。使用FACS 流式細胞術和Cell-Quest 軟件分析凋亡細胞數。

2.6 Western blot 檢測細胞蛋白表達 操作方法大致如下∶20μg/mL 的蛋白經10% SDS-PAGE 處理后轉移到PVDF 膜上。將膜在4℃分別與Bcl-2（1:1000）、Bax （1:1000）、LC3-Ⅰ/Ⅱ（1:1000）、p62（1:5000）或GAPDH（1:5000）抗體孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔/小鼠IgG 抗體（1:5000）室溫下孵育2h，使用化學發光試劑顯色檢測蛋白表達，ImageJ 軟件統計分析蛋白灰度。

2.7 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件分析數據，數據以均數±標準差（） 表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及t 檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TST 含藥血清提高OGD 心肌細胞活力 不同濃度TST 含藥血清處理OGD 心肌細胞24h，MTT 檢測結果顯示，隨著TST 含藥血清濃度的增加，細胞活力顯著升高（P＜0.05），見表1。

表1 各組心肌細胞活力比較（%，）

表1 各組心肌細胞活力比較（%，）

注∶OGD 為氧糖剝奪；TST 為桃紅四物湯；與對照組比較，aP＜0.05；與OGD 模型組比較，bP＜0.05；與OGD+5%TST 含藥血清組比較，cP＜0.05；與OGD+10%TST 含藥血清組比較，dP＜0.05

3.2 TST 含藥血清聯合自噬提高OGD 心肌細胞活力 雷帕霉素誘導OGD 心肌細胞自噬，聯合TST 含藥血清處理OGD 心肌細胞，細胞活力顯著升高（P＜0.05），氯喹抑制OGD 心肌細胞自噬，聯合TST 含藥血清處理OGD 心肌細胞，細胞活力下降（P＜0.05）。見表2。

3.3 TST 含藥血清聯合自噬抑制OGD 心肌細胞凋亡 與對照組比較，OGD 模型組心肌細胞凋亡比例顯著升高（P＜0.05）；TST 含藥血清處理OGD 心肌細胞，細胞凋亡比例降低（P＜0.05），雷帕霉素誘導OGD心肌細胞自噬，細胞凋亡比例進一步降低（P＜0.05），氯喹改變溶酶體pH，溶酶體功能受損，細胞自噬被抑制，細胞凋亡比例升高（P＜0.05）。見表3、插頁圖1。

表2 各組心肌細胞活力比較（%，）

表2 各組心肌細胞活力比較（%，）

注∶OGD 為氧糖剝奪；TST 為桃紅四物湯；與對照組比較，aP＜0.05；與OGD 模型組比較，bP＜0.05；與OGD+TST 含藥血清組比較，cP＜0.05

表3 各組心肌細胞凋亡比例比較（%，）

表3 各組心肌細胞凋亡比例比較（%，）

注∶OGD 為氧糖剝奪；TST 為桃紅四物湯；與對照組比較，aP＜0.05；與OGD 模型組比較，bP＜0.05；與OGD+TST 含藥血清組比較，cP＜0.05

3.4 TST 含藥血清促進OGD 心肌細胞自噬抑制凋亡蛋白表達 與對照組比較，OGD 模型組p62 和Bax 蛋白表達增多、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Bcl-2 蛋白表達減少；與OGD 模型組比較，TST 含藥血清處理OGD 心肌細胞，Bcl-2 和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值明顯增多，Bax 和p62 表達明顯減少；與OGD+TST 含藥血清組比較，OGD+TST 含藥血清+雷帕霉素組Bcl-2和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增多，Bax 和p62 表達顯著減少；OGD+TST 含藥血清+氯喹組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Bcl-2 表達減少，p62、Bax 蛋白表達增多。見插頁圖2。

3 討論

心肌細胞凋亡是冠心病等心血管疾病的重要病理表現，抑制心肌細胞凋亡可有效改善心血管疾病心功能[10]。本研究通過體外OGD 處理心肌細胞構建心血管疾病體外模型，通過不同濃度TST 含藥血清處理OGD 心肌細胞，發現細胞活力升高，細胞凋亡比例下降，表明TST 對心肌缺血損傷具有保護作用，但具體機制尚不明確。

自噬在心肌缺血損傷中發揮復雜作用，自噬抑制加重缺血損傷，腺苷和白藜蘆醇等心臟保護劑抑制自噬減輕心肌損傷[11-12]。目前普遍認為適度的自噬通過降解和清除受損的細胞器提高細胞存活率，抑制細胞凋亡[7，13]。本研究發現，TST 促進細胞自噬，抑制OGD 誘導的心肌細胞凋亡，氯喹抑制自噬導致TST 的心肌保護作用喪失，細胞存活率降低，細胞凋亡增多。上述結果表明TST 通過增強自噬抑制細胞凋亡，在心肌細胞損傷中發揮保護作用。

綜上所述，桃紅四物湯促進細胞自噬，抑制OGD誘導的心肌細胞凋亡，發揮保護作用。