COX-2 和Ki-67 在甲狀腺癌組織表達及臨床意義

陳 亮 趙賢寶 傅 超

甲狀腺癌是常見的一種頭頸部惡性腫瘤。目前，甲狀腺癌術前診斷主要依據針吸細胞學及甲狀腺彩超檢查，但具有明顯的局限性，并且容易出現假陰性。環氧化酶（COX）又稱為前列腺素H 合成酶，參與機體的各種生理過程，研究顯示，COX-2 在多種惡性腫瘤中過表達，而其在甲狀腺癌中研究甚少。Ki-67抗原作為應用最廣泛的腫瘤細胞增殖標志，與腫瘤細胞有絲分裂關系相關[1-2]。本研究旨在探討COX-2和Ki-67 在甲狀腺癌組織表達及臨床意義。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇浙江省義烏市中心醫院腫瘤科2017 年6 月—2019 年6 月行手術治療的甲狀腺癌患者的甲狀腺癌組織作為觀察組，共87 例。甲狀腺癌依據《2010 年版甲狀腺腫瘤治療指南》[3]中相關診斷標準。選擇同期手術治療的甲狀腺良性病變的正常甲狀腺組織83 例作為對照組。本研究通過醫院倫理委員會審核。

1.2 納入和排除標準 納入標準∶（1）符合甲狀腺癌診斷標準，且經臨床表現、影像學檢查及術后病理證實為甲狀腺癌；（2）患者均行手術治療并獲得知情同意；（3）年齡≥60 歲且≤80 歲。排除標準∶（1）臨床資料不完整；（2）術前接受放療或化療者；（3）合并其他惡性腫瘤；（4）手術禁忌者。

2 方 法

2.1 免疫組化法測定COX-2 和Ki-67 表達陽性率取甲狀腺癌組織標本和正常甲狀腺組織標本，4%甲醛固定，常規石蠟包埋，連續切片約為3μm，采用二甲苯脫蠟梯度乙醇脫水。將切片放于10mM、250mL 的檸檬酸緩沖液（pH=6）中，再將其放于高壓鍋（100℃）中煮沸30min 修復抗原，操作標準按照免疫組織化學SP 試劑盒（福州邁新生物試劑公司，批號1610272、1607131）嚴格進行，采用DAB 顯色，蘇木精復染脫水，透明封固。COX-2 和Ki-67 結果判定[3]∶分別于高倍鏡下取不同視野5 個，計數陽性細胞數200 個，取平均值計算陽性率。COX-2 和Ki-67均于細胞核以及細胞質中表達[3]∶（1）著色程度∶以無色為計分0 分，以淡黃色為計分1 分，以棕黃色為計分2 分，以褐色與黑色為計分3 分；（2）陽性細胞計數∶以陽性細胞＜10%為計分1 分，以陽性細胞11%～50%為計分2 分，以陽性細胞51%～75%為計分3 分，以陽性細胞＞75%為計分4 分。陽性細胞所占百分比及染色程度相乘∶其中以計分＜3 分為（-），以計分≥3分為（+）。

2.2 Western blot 測定COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值 取甲狀腺癌組織標本和正常甲狀腺組織標本加入細胞裂解液，勻漿裂解約35min，以離心轉速10000r/min，離心半徑15cm 離心5min，收集上清液進行蛋白定量。取30μg 總蛋白進行SDS-PAGE，加入一抗COX-2 和Ki-67 孵育1h，再加入辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（IgG）二抗孵育1h，采用化學發光、顯影、定影，以β-actin 蛋白作為內參照。兔抗人單克隆抗體COX-2 和兔抗人多克隆抗體Ki-67來源于北京中杉金橋生物技術開發有限公司（批號1602181、1608292）。

2.3 統計學方法 應用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（） 表示，采用t 檢驗；計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 兩組研究對象一般資料比較 觀察組87 例，男20 例，女67 例；年齡60～78（69.43±5.64）歲；病程（3.17±0.76）年；TNM 分期[3]∶Ⅰ～Ⅱ期53 例，Ⅲ～Ⅳ期34 例；包膜浸潤30 例；淋巴結轉移28 例。對照組83例，男16 例，女67 例；年齡62～79（70.31±6.27）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

3.2 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 表達陽性率比較 觀察組COX-2 和Ki-67 表達陽性率高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 表達陽性率比較[例（%）]

3.3 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值比較 觀察組COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值高于對照組（P＜0.05）。見表2、圖1。

3.4 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67表達陽性率比較 不同性別、年齡和TNM 分期COX-2 和Ki-67 表達陽性率比較差異無統計學意義（P＞0.05）；有包膜浸潤和淋巴結轉移COX-2 和Ki-67 表達陽性率高于無包膜浸潤和淋巴結轉移（P＜0.05）。見表3。

表2 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值比較（）

表2 兩組甲狀腺組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值比較（）

注∶觀察組為甲狀腺癌組織；對照組為正常甲狀腺組織；COX-2 為環氧化酶-2

3.5 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67蛋白表達灰度值比較 不同性別、年齡和TNM 分期COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值比較差異無統計學意義（P＞0.05）；有包膜浸潤和淋巴結轉移蛋白表達灰度值高于無包膜浸潤和淋巴結轉移（P＜0.05）。見表4。

4 討論

COX-2 蛋白誘導型酶，其在細胞受刺激啟動炎性反應或機體出現腫瘤病變時急速合成，而其在細胞組織靜息時一般不表達[4]。COX-2 參與機體多個病理生理過程，并且熱休克蛋白、維甲酸、癌基因和脂多糖等多種因素均可誘導COX-2 合成[5]。近年研究顯示，多種惡性腫瘤中發現COX-2 高表達，認為其可能與腫瘤發生、發展存在相關性[6-7]。此外，COX-2 過表達可抑制細胞凋亡且促進細胞增殖，從而使細胞增殖和凋亡間平衡失調，進一步促進腫瘤走向惡性[8]。Ki-67 抗原主要由兩條多肽鏈組成，基因定位于10 號染色體，Ki-67 與細胞有絲分裂密切相關，其表達除G0 期以外的所有時期，于細胞周期G1 期開始，并且于S 期及G2 期逐漸增加至M 期達巔峰，目前是細胞增殖能力應用最廣泛并且最具代表性的一種腫瘤標志物[9-10]。臨床研究顯示，Ki-67 高表達不僅與腫瘤的生物學形成相關，并且與臨床預后密切相關[11]。Ki-67 在乳腺浸潤性導管癌中與雌激素受體呈負相關，其可能與腫瘤分化程度相關[12]。研究發現，Ki-67 在甲狀腺癌研究中可反映甲狀腺癌細胞的增殖活性，可作為評估甲狀腺癌生物學行為以及惡性程度的一種重要指標[13]。本研究結果顯示，觀察組COX-2 和Ki-67 表達陽性率和蛋白表達灰度值高于對照組（P＜0.05），有包膜浸潤和淋巴結轉移COX-2和Ki-67 表達陽性率與蛋白表達灰度值高于無包膜浸潤和淋巴結轉移（P＜0.05）。提示甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 表達升高，COX-2 和Ki-67 異常表達可能參與甲狀腺癌的發生和發展過程，且與淋巴轉移和包膜浸潤相關，可作為判斷甲狀腺癌預后參考指標。

表3 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 表達陽性率比較[例（%）]

表4 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值比較（）

表4 不同病理特征甲狀腺癌組織COX-2 和Ki-67 蛋白表達灰度值比較（）