宮頸鱗癌組織ARMCX1 和MMP-9 表達及臨床意義

袁馬馳 許國富

宮頸鱗癌臨床較為常見，發生具有雙峰的特征，病變形成與機體基因表達失常有關[1-2]。ARM 重復蛋白家族是腫瘤進展相關的蛋白質，其含有多個Armadillo repeat 結構，在正常機體中極少表達，在腫瘤細胞表達明顯上調，對細胞間通信有明顯的調節作用[3]。ARM 重復X 連鎖蛋白1（ARMCX1）是家族中最早發現的成員，細胞損傷后其分泌增多，對細胞增殖和細胞的遷移有明顯的促進作用。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）是基質金屬蛋白酶中的重要成分，具有顯著降解明膠的作用，還能引起IV 型膠原、基底膜的降解，同時對層粘連蛋白有一定的調節作用[4-5]。本研究探討宮頸鱗癌組織ARMCX1 和MMP-9 表達及其臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013 年1 月—2014 年2 月期間在杭州市第三人民醫院和浙江中醫藥大學附屬第二醫院確診為宮頸鱗癌的患者67 例作為觀察組，選取同期確診為子宮肌瘤或子宮腺肌癥行子宮全切患者67 例作為對照組。均留取兩組的石蠟包埋組織和新鮮凍存組織（-80℃凍存）。本研究經醫院倫理委員會審核通過，并取得患者知情同意。

1.2 納入、排除標準 納入標準∶（1）符合WHO 宮頸癌病理診斷標準及分型；（2）術前未接受放療或化療；（3）均行宮頸癌切除術+盆腔淋巴結清掃術；（4）有完整的病理資料。排除標準∶（1）轉移性鱗癌；（2）雙原發癌；（3）生殖系統畸形或發育異常；（4）1 個月內使用過免疫抑制劑。

1.3 主要試劑 ARMCX1、MMP-9、二抗和DAB 均購自蘇州睿贏生物技術公司，ARMCX1 （批號RLT0331）和MMP-9（批號RLT1892），均為濃縮液。先行預實驗，選擇配比濃度ARMCX1（1∶200）和MMP-9（1∶100）顯色最理想的濃度用于正式實驗。

1.4 免疫組化實驗 基于石蠟包埋組織，應用免疫組化SP 法檢測ARMCX1 和MMP-9 表達，DAB 顯色，嚴格按實驗步驟操作。二者的陽性部位是細胞質，以淡黃-棕褐色定為陽性。

1.5 Western blot 實驗 基于新鮮凍存標本檢測ARMCX1 和MMP-9 表達。嚴格按實驗步驟進行蛋白提取、蛋白濃度測定、蛋白變性、加樣、電泳、電轉膜、免疫雜交后，取出膜后加入發光液，發光2min。將膜取出放入X 膠片盒曝光3min，顯影20s。應用Image J 軟件進行分析，以目的蛋白與GAPDH 的灰度比值作為相對表達量。

1.7 統計學方法 應用SPSS 17.0 進行數據分析，組間率的比較行卡方檢驗，兩組間定量資料的比較行配對t 檢驗和獨立樣本t 檢驗，多組間比較行方差分析，并應用Pearson 相關分析和K-M 生存分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 觀察組患者年齡31～86（45.1±6.3）歲，體質量42～87（55.1±10.5）kg，身高135～185（165.8±16.7）cm；病程1～4（2.1±0.3）個月。對照組年齡38～78（46.2±6.1）歲，體質量41～80（54.7±13.4）kg，身高139～182（164.2±17.4）cm；病程1～4（1.8±0.2）個月。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 免疫組化結果 ARMCX1 蛋白定位于宮頸鱗癌的細胞漿和細胞膜，部分強表達的腫瘤在細胞核也能觀察到，均染成棕黃色，本組共65 例呈強陽性，2 例呈弱陽性。MMP-9 蛋白定位于宮頸鱗癌細胞的細胞漿和細胞膜，均染成棕黃色。ARMCX1 和MMP-9 在正常宮頸鱗狀上皮均不表達。見插頁圖1-4。

2.3 Western blot 法檢測兩組ARMCX1 和MMP-9蛋白表達量比較 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1、插頁圖5。

表1 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

表1 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

注∶觀察組為宮頸鱗癌患者；對照組為子宮肌瘤或子宮腺肌癥患者；ARMCX1 為ARM 重復X 連鎖蛋白1；MMP-9 為基質金屬蛋白酶-9

2.4 流式細胞檢測兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

表2 兩組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

注∶觀察組為宮頸鱗癌患者；對照組為子宮肌瘤或子宮腺肌癥患者；ARMCX1 為ARM 重復X 連鎖蛋白1；MMP-9 為基質金屬蛋白酶-9

2.5 觀察組不同臨床病理特征分組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較 在不同脈管浸潤、病理分型及淋巴結轉移分組ARMCX1 和MMP-9 表達量差異有統計學意義（P＜0.05）；不同增殖指數分組ARMCX1表達量差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

2.6 觀察組ARMCX1 和MMP-9 表達相關性分析Pearson 相關性分析顯示，ARMCX1 和MMP-9 之間呈正相關性（r=0.43，P=0.034）。

2.7 ARMCX1 和MMP-9 表達生存分析 本組隨訪時間5～60 個月，經K-M 生存分析顯示，ARMCX1（χ2=4.36，P=0.032）和MMP-9（χ2=5.02，P=0.013）表達與生存時間相關。見插頁圖6-7。

3 討論

宮頸鱗狀細胞常由鱗狀上皮內病變（低級別和高級別病變）發展而來，與HPV 感染關系密切，最常見的是非角化型。病理形態上顯示腫瘤細胞的異型性明顯，浸潤、侵襲和轉移能力強，部分患者預后不良[6]。研究認為，鱗癌發生時多種蛋白表達出現異常，對促進病變進展有明確作用[7]。

ARMCX1 對組織的修復和細胞的分化均具有重要作用。有學者在神經損傷的上皮中觀察ARMCX1的表達，認為其對線粒體的運輸能力有調控作用[8]。MMP-9 也稱為明膠酶B，是經典的促進腫瘤遷移的蛋白，學者認為其在全身的大部分腫瘤中高表達，并能對底物進行溶解，使轉移的通路打開[9]。MMP-9 也具有癌基因樣的作用，具有促進細胞增殖，減少腫瘤細胞凋亡。由于間質血管新生與腫瘤的形成密切相關，而MMP-9 對間質中CD105 陽性的血管有明顯的促進作用[10]。MMP-9 在促進血管生成過程中可能與VEGF 的介導有關[11]。

本研究結果顯示，觀察組兩種蛋白表達高于對照組（P 均＜0.05），提示ARMCX1 和MMP-9 高表達能促進宮頸鱗癌的形成，ARMCX1 和MMP-9 具有癌基因樣的腫瘤促進作用。腫瘤組織ARMCX1 和MMP-9 表達與病變的脈管浸潤（P＜0.05）和淋巴結轉移相關（P＜0.05），提示兩者對轉移和脈管浸潤有促進作用。ARMCX1 和MMP-9 可能是臨床判斷潛在轉移的分子因素。ARMCX1 和MMP-9 與病變的分型有關（P＜0.05），提示兩者可能是病理分型的鑒別抗體。臨床上非角化型癌的預后差，因此聯合檢測ARMCX1 和MMP-9 表達可能與預后有一定的關聯（P均＜0.05）。生存分析證實ARMCX1 和MMP-9 高表達患者的預后差，因此檢測組織ARMCX1 和MMP-9的表達可能是獨立的預后指標，這為臨床判斷腫瘤的生物學行為提供了客觀依據。本研究結果還顯示，ARMCX1 表達與增殖指數有關（P＜0.05），提示ARMCX1 可能對促進細胞增殖有重要意義。ARMCX1 和MMP-9 具有正相關性（P＜0.05），提示二者具有正向協同作用。ARMCX1 可能是上游基因，調節MMP-9的表達，促進明膠、基底膜、IV 型膠原及層粘連蛋白的溶解，加速腫瘤性病變的進展。ARMCX1 對增殖和遷移的作用可能是間接的[12]。ARMCX1 分泌增加，引起腫瘤細胞生長和分化，腫瘤處于進展期[13]。MMP-9還可能是干細胞分化和調控的重要基因，如對細胞從幼稚向成熟分化，粘附分子的激活等。缺氧誘導因子也能激活MMP-9 的表達，對促進其分泌及功能有調節作用[14]。

表3 觀察組不同臨床病理特征分組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

表3 觀察組不同臨床病理特征分組ARMCX1 和MMP-9 表達量比較（）

注∶觀察組為宮頸鱗癌患者；ARMCX1 為ARM 重復X 連鎖蛋白1；MMP-9 為基質金屬蛋白酶-9

綜上所述，宮頸鱗癌組織ARMCX1 和MMP-9表達上調，兩者具有正向協同作用，術后檢測ARMCX1 和MMP-9 高表達患者的預后差。