白藜蘆醇通過PI3K/Akt/GSK-3β通路對6-OHDA致帕金森病小鼠神經退行性病變改善的作用研究

楊小鷗，楊國偉，劉志孝，孫 靜

帕金森病(Parkinson′s disease)是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，老年人群發病率位居第二位，僅次于阿爾茨海默病[1]，其病理特征主要是中腦黑質區域致密部多巴胺能神經元變性或缺失，導致紋狀體多巴胺能神經元減少及Lewy氏小體形成[2-3]。臨床主要表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵硬等一系列運動功能障礙[4]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[5]，主要依賴于其對底物的磷酸化作用，參與細胞增殖、凋亡等過程，在帕金森病發展過程中起重要作用[6-7]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)信號轉導通路是近年來發現的，參與調控細胞凋亡的一條重要信號通路，其活化后使GSK-3β失活，從而避免細胞凋亡的發生[8-9]。白藜蘆醇是廣泛存在于各種水果、蔬菜中的一種多酚類化合物[10]，具有抗炎、抗氧化應激及抗凋亡作用[11]，且有研究證實其通過多種途徑對帕金森病等神經退行性疾病具有一定的保護作用[12]，但白藜蘆醇通過PI3K/Akt/GSK-3β通路改善帕金森病的神經退行性病變報道較少。本研究探討白藜蘆醇通過PI3K/Akt/GSK-3β通路改善6-羥基多巴胺(6-OHDA)所致帕金森病小鼠神經退行性病變，從而為白藜蘆醇的臨床使用提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6雄性小鼠，10～11周齡，體重20～25 g，購自濟南朋悅實驗動物繁殖有限公司，動物批號：SCXK(魯)20170001，飼養于沈陽醫科大學實驗動物中心潔凈動物實驗室恒溫恒濕SPF級條件下，高壓滅菌飲用水和飼料，自由攝取。

1.2 實驗試劑 白藜蘆醇購自湖南正清生物有限公司；TUNEL試劑盒購自北京碧云天生物科技有限公司；磷酸化蛋白激酶(p-Akt)鼠源單抗、磷酸化糖原合成酶激酶3(p-GSK-3β)兔源單抗、PI3K兔源單抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)鼠源單抗、抗兔二抗、抗鼠二抗均購自美國Cell Signaling公司；Caspase-3及內參引物由上海生工生物工程有限公司合成；實驗所用其他試劑購自上海生工生物公司。

1.3 動物分組 將30只SPF級C57BL/6小鼠隨機分為正常組、6-OHDA致病組和白藜蘆醇治療組(Res治療組)，每組10只。Res治療組小鼠在造模前3 h按照20 mg/kg劑量給予灌胃，此后每日均按此標準灌胃1次，持續至造模后2周；6-OHDA致病組和正常組均給予等量生理鹽水灌胃。

1.4 6-OHDA致帕金森病小鼠模型建立 將6-OHDA在避光條件下溶解于含0.02%抗壞血酸生理鹽水(NS)溶液中，調整濃度為2 μg/μL。隨機選取20只實驗小鼠，以0.15%的戊巴比妥按照0.2 mL/kg腹腔注射麻醉。小鼠麻醉后固定于立體定位儀裝置上，頭皮剪開，暴露頭骨。選擇黑質致密部，將裝有6-OHDA溶液的微量注射器插入，推動速度為1 μL/min，每只小鼠腦內注射兩個位點，每個位點注射2 μL，停止注射4 min后拔針，以免試劑外泄。注射完畢后將小鼠從立體定位儀上取下，并縫合頭皮。正常組小鼠腦內注射同等劑量生理鹽水。

1.5 組織取材 造模后2周將小鼠處死，分離腦組織黑質，一部分固定于多聚甲醛中，24 h后石蠟包埋，制備5μm厚度組織切片；另一部分置于-80 ℃冰箱保存。

1.6 觀察指標

1.6.1 行為學觀察 造模2周后，給予各組小鼠0.5 mg/mL嗎啡腹腔注射，以誘導小鼠旋轉，觀察行為變化，并記錄小鼠旋轉圈數。

1.6.2 TUNEL染色觀察腦黑質內多巴胺神經元凋亡 組織石蠟切片脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，之后在3%H2O2中浸洗，加組織蛋白酶K去除蛋白，加TUNEL反應溶液，室溫避光孵育1 h后用PBS洗滌，加入信號轉化劑，之后用3，3二氨基聯苯胺四氯化碳(DBA)顯色處理，最后每個樣本上加蘇木素，15 s后迅速擦拭，光學顯微鏡下觀察細胞核染色情況。

1.6.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測實驗小鼠腦黑質內Caspase-3基因表達 取腦黑質組織約50 mg，Trizol提取總RNA，進行逆轉錄反應。取2 μL RNA進行PCR擴增，內參GAPDH引物序列，上游：ATGCTATTGCGATAGCGATC；下游：ATCGGATTCGATCGATCGA。Caspase-3引物序列，上游：TCGATCGATCGGCAAATCGA；下游：TCGATCGACGTTGCATGCATT。擴增條件：94 ℃預變性2 min，1個循環；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，36個循環；72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳條帶，分析目的基因和參比基因的條帶灰度值。

1.6.4 蛋白印跡法(Western Blot)檢測實驗小鼠腦黑質內p-GSK-3β、PI3K、p-Akt蛋白含量 將腦黑質組織剪成小塊，加入蛋白裂解液，提取蛋白質，離心取上清液，取50 μg總蛋白進行鈉十二烷基的硫酸鹽聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，隨后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶封閉，加一抗，同時以GAPDH為內參，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖鹽溶液洗滌，根據一抗種屬加入相應二抗，室溫孵育1 h，ECL顯色，將膠片掃描后使用Bandscan5.0軟件進行蛋白灰度分析。

2 結 果

2.1 帕金森病動物模型建立 本研究采用右側紋狀體注射方法建立帕金森病動物模型，造模后第14天皮下注射嗎啡誘發小鼠旋轉，結果顯示，正常組小鼠無任何行為學改變，6-OHDA致病組和Res治療組小鼠注射嗎啡5 min后誘發向右側旋轉，6-OHDA致病組小鼠30 min內向右旋轉圈數為(203.37±8.32)圈，Res治療組為(102.53±10.03)圈，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明白藜蘆醇能改善6-OHDA所致行為異常。

2.2 TUNEL檢測帕金森病小鼠腦黑質內多巴胺神經元凋亡 光學顯微鏡下各組細胞核染色圖像見圖1。6-OHDA致病組小鼠腦黑質內多巴胺神經元凋亡率高于正常組(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質內巴胺神經元凋亡率低于6-OHDA致病組(P<0.05)，說明白藜蘆醇能有效抑制PD小鼠腦黑質內巴胺神經元凋亡。詳見圖2。

圖1 光學顯微鏡下各組細胞核染色圖像

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

2.3 RT-PCR檢測實驗小鼠腦黑質內Caspase-3含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質內Caspase-3含量較正常組增加(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質內Caspase-3表達較6-OHDA致病組明顯降低(P<0.05)。說明白藜蘆醇能抑制PD小鼠腦黑質內Caspase-3含量。詳見圖3。

與6-OHDA組比較，＊P<0.05。

2.4 Western Blot檢測實驗小鼠腦黑質內PI3K蛋白含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質內PI3K蛋白含量低于正常組(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質內PI3K蛋白含量較6-OHDA致病組小鼠增加(P<0.05)。詳見圖4。

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

2.5 Western Blot檢測實驗小鼠腦黑質內p-GSK-3β蛋白含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質內p-GSK-3β蛋白含量低于正常組(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質內p-GSK-3β蛋白含量較6-OHDA致病組小鼠提高(P<0.05)。詳見圖5。

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

2.6 Western Blot檢測實驗小鼠腦黑質內p-Akt蛋白含量 6-OHDA致病組小鼠腦黑質內p-Akt蛋白含量較正常組降低(P<0.05)，Res治療組小鼠腦黑質內p-Akt蛋白含量較6-OHDA致病組升高(P<0.05)。詳見圖6。

與6-OHDA致病組比較，＊P<0.05。

3 討 論

帕金森病是老年人群發病率較高的一種中樞神經退行性疾病，其發病原因復雜，與遺傳、感染、免疫功能失調等因素均有關[1-2]。白藜蘆醇是廣泛存在于各種水果、蔬菜中的一種多酚類化合物[10-11]，相關研究證實，白藜蘆醇通過緩解線粒體功能障礙、激活ERK通路、激活沉默信息調節因子(SIRT1)蛋白等多種途徑對帕金森病起到神經保護作用[12-13]。

有研究發現，細胞凋亡引起的腦黑質紋狀體內多巴胺能神經元缺失是引發帕金森病的一個重要原因[14]。早期研究發現，帕金森病病人腦內凋亡的神經元數量較正常人增加[15]，有學者使用TUNEL染色法在因帕金森病死亡病人腦內發現凋亡神經元存在[6]。本研究使用6-OHDA誘導小鼠建立帕金森病模型，造模成功后，實驗小鼠出現運動功能障礙，同時TUNEL染色顯示6-OHDA致病組小鼠腦黑質內多巴胺能神經元凋亡率高于正常組。

Caspase在細胞凋亡過程中發揮關鍵作用，是所有凋亡途徑的關鍵效應器，RT-PCR檢測結果發現，6-OHDA致病組小鼠腦黑質內凋亡蛋白Caspase-3含量增加，說明帕金森病小鼠腦內Caspase-3被激活，從而引發多巴胺能神經元凋亡。白藜蘆醇治療后，帕金森病小鼠運動功能障礙得到顯著改善，腦黑質內Caspase-3含量被顯著抑制，且多巴胺神經元凋亡比例較6-OHDA致病組小鼠下降。說明白藜蘆醇能抑制帕金森病小鼠腦黑質內Caspase-3含量，降低多巴胺神經元凋亡，從而改善神經退行性病變。

GSK-3β在中樞神經系統中廣泛表達，與神經凋亡相關的神經退行性疾病密切相關，如帕金森病[5]、阿爾茨海默病等[6]。有研究發現，GSK-3β在細胞活動中與多個信號通路密切相關，其活化受到多種機制調控，其中N端第9位絲氨酸殘基(Ser9)被磷酸化時，GSK-3β活性被抑制[16]。帕金森病發病過程中，GSK-3β活化上調多巴胺能神經內Caspase-3含量，從而促進細胞凋亡的發生[15]。有研究發現，GSK-3β抑制劑可抑制Caspase-3表達，從而抑制多巴胺神經元凋亡[15]。本研究結果發現，與正常組相比，6-OHDA致病組腦黑質內p-GSK-3β含量降低；Res治療組小鼠腦黑質內p-GSK-3β含量較6-OHDA致病組提高，說明白藜蘆醇對帕金森病小鼠腦黑質內多巴胺神經元凋亡及Caspase-3含量的抑制作用可能通過提高p-GSK-3β含量實現。

PI3K/Akt信號轉導通路是近年來發現的、參與細胞凋亡調控的一個重要信號通路[5]。PI3K通過磷酸化Akt蛋白Ser473位點使Akt活化，而活化后的Akt通過p-GSK-3β的Ser9位點抑制GSK-3β活性，避免細胞凋亡的發生[6-7]。相關研究發現，在帕金森病發展過程中，使用PI3K抑制劑wortmannin阻斷PI3K/Akt通路，解除p-GSK-3β，加重多巴胺神經元凋亡[14-15]。本研究結果發現，6-OHDA致病組小鼠腦黑質內PI3K和Akt磷酸化水平較正常小鼠均降低，經白藜蘆醇干預后，PI3K和Akt磷酸化水平均升高，說明白藜蘆醇能激活帕金森病小鼠腦黑質內PI3K/Akt通路，從而減弱GSK-3β活性，減少多巴胺神經元凋亡。

綜上所述，本研究證實白藜蘆醇能有效改善由6-OHDA誘導的帕金森病小鼠模型運動功能障礙，并降低腦黑質內多巴胺神經元凋亡，這種抑制作用可能通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，抑制GSK-3β活性而實現。