非瓣膜性心房顫動病人血漿miR-486和miR-150表達水平及臨床意義

胡雪紅，譚 琛，安立敏，王志娟，王鳳楠

心房顫動是常見的慢性持續性心律失常之一，導致心房失去收縮功能[1]。目前臨床病例中心房顫動多由非瓣膜病引起，而非瓣膜性心房顫動病人發生腦卒中風險較高，對病人危害較大[2]。臨床主要采用手術或藥物等方式治療心房顫動，但治療效果不佳，因而需尋找新型生物標志物并以此提高臨床治療效果。微小RNA(microRNA，miRNA)是長度為20～25個核苷酸的單鏈內源性非編碼分子并具有保守性和特異性，有研究表明miRNA可參與心房顫動的心房重構并在疾病的發生、發展中發揮重要作用[3]。miR-486分布于心肌細胞中并通過調控靶mRNA表達進而參與心功能調節[4]。相關研究表明，miR-486與miR-150共同作用并參與心肌梗死的發生及進展過程，并可能是心肌梗死的新型生物標志物[5]。本研究觀察非瓣膜性心房顫動病人血漿miR-486與miR-150表達水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2018年8月我院收治的非瓣膜性心房顫動病人86例作為研究組，另選取同期收治的竇性心律病人67例作為對照組。研究組，男52例，女34例，年齡48～75(59.37±9.89)歲；對照組，男37例，女30例，年齡49～76(62.03±10.34)歲。兩組性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。研究組納入標準：心電圖特征符合相關診斷標準[6]，符合非瓣膜性心房顫動病人相關診斷標準[7]，臨床資料完整者；對照組心電圖檢查與既往病史均無心房顫動，臨床資料完整者。排除標準：近期接受心房顫動復律術病人；急性、慢性炎癥性疾病病人；自身免疫性疾病病人；患有惡性腫瘤；嚴重肝腎功能不全；妊娠期婦女；發病初期服用維生素或葉酸者。本研究經醫院倫理委員會批準，且病人知情并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗儀器與試劑 電泳儀購自北京六一儀器廠，離心管購自美國Axygen公司，超低溫冰箱購自日本Sanyo公司，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)儀選購自Applied Biosystems公司，RNA提取試劑盒購自Bio Teke公司，SYBR Green qPCR Mix試劑盒購自Thermo Fisher公司，All-in-One TM miRNA qRT-PCR Detection kit試劑盒購自美國Gene Copoeia公司。全自動血細胞分析儀BC-5380購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；TBA 120FR全自動生化分析儀購自日本東芝公司。

1.2.2 血液樣本收集 收集兩組研究對象入院后次日清晨空腹外周血樣本，分別抽取5 μL血液并置于EDTA抗凝管中，其余血液樣本按要求置于普通生化管內。將EDTA抗凝管中的血液樣本于室溫下靜置，30 min后以3 000 r/min離心10 min，將分離得到的上層血漿在2 h內分裝至EP管中，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 觀察指標

1.3.1 qRT-PCR法檢測miR-486與miR-150表達水平 取凍存的血漿樣本并在離心管中按照200 μL血漿加入1 000 μL QIAzol Lysis Reagent裂解液(1︰5)進行裂解樣本。按照RNA試劑盒說明書提取總RNA，將RNA反轉錄為cDNA并以其為模板分別對miR-486與miR-150進行qRT-PCR檢測。miR-486與miR-150均以U6為內參基因，其中miR-486正向引物序列為5′-GATCAATCCTGTACTGAGCTGC-3′，miR-150正向引物序列為5′-TAGACGCGTCCGCGAGAGA-3′，miR-486與miR-150反向引物序列均由試劑盒內提供，U6正向引物序列為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應體系為20 μL：SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環。反應結束后收集數據，并對所得數據Ct值進行分析，每個樣本進行3次平行試驗，采用2-ΔΔCt計算miR-486與miR-150相對表達量。

1.3.2 心臟彩超檢查 所有病人均在醫院B超室進行心臟彩超檢查，測定左房內徑(LAD)等。

1.3.3 生化指標檢測 將普通生化管內血液樣本簡單離心，抽取上層血漿采用氧化酶法檢測總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量。采用免疫比濁法檢測血清C反應蛋白(CRP)水平。采用全自動血細胞分析儀檢測白細胞(WBC)、血紅蛋白(Hb)及紅細胞比容(HCT)，采用全自動生化分析儀進行血肌酐(SCr)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)。心房顫動卒中風險評估工具為CHADS2評分系統和2010歐洲心房顫動管理指南推出的CHA2DS2-VASC評分系統評分，心房顫動出血風險評分標準(HAS-BLED)評定心房顫動出血風險評分。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較(見表1)

表1 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血漿miR-486與miR-150表達水平比較 與對照組比較，研究組血漿miR-486與miR-150表達水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組血漿miR-486與miR-150表達水平比較(±s)

2.3 研究組血漿miR-486、miR-150與臨床指標的相關性分析 采用Pearson分析非瓣膜性心房顫動病人血漿miR-486、miR-150表達水平與臨床指標的相關性，結果顯示miR-486與miR-150呈正相關(P<0.05)，詳見圖1。miR-486、miR-150與LAD、CRP呈負相關，與LDL-C、TC呈正相關，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

圖1 血漿miR-486與miR-150表達水平的散點圖

表3 研究組血漿miR-486、miR-150及與臨床指標的相關性

2.4 ROC分析miR-486、miR-150預測非瓣膜性心房顫動的診斷價值 ROC分析結果顯示：miR-486敏感度為59.30%，特異度為93.02%，截斷值為0.84；miR-150敏感度為82.56%，特異度為70.93%，截斷值為1.14。詳見圖2、表4。

圖2 miR-486、miR-150對非瓣膜性心房顫動的ROC曲線圖

表4 研究組血漿miR-486、miR-150對非瓣膜性心房顫動的ROC分析

2.5 影響非瓣膜性心房顫動相關因素的Logistic多元回歸分析 將影響非瓣膜性心房顫動的相關因素進行Logistic多元回歸分析結果顯示：LAD、CRP、miR-486與miR-150表達水平均為非瓣膜性心房顫動發生的危險因素，詳見表5。

表5 影響非瓣膜性心房顫動相關因素的Logistic多元回歸分析

3 討 論

心房顫動是臨床常見的心律失常易引起心功能障礙、卒中等，嚴重影響病人生活質量，其中非瓣膜性心房顫動發病率與死亡率近年來呈上升趨勢[8]。目前心房顫動整體治愈率低且復發率高可能與發病機制未明確有關，以往研究表明炎癥反應、心房重構、心肌細胞凋亡等是心房顫動發生的重要原因[9]。有研究已證實，miRNA通過調控心肌離子通道、心肌纖維化或細胞外基質沉積參與心房顫動的心房重構[10]。因此，本研究探討miRNA在非瓣膜性心房顫動病人血漿表達水平并分析其與病人臨床生化指標關系，為進一步探討非瓣膜性心房顫動發病機制，提高臨床治療效果提供理論依據。

miR-486可在心肌細胞表達，并根據miRNA靶點數據庫預測到FoxO1a為miR-486的靶基因，有研究表明FoxO家族參與調節多種細胞功能，FoxO1a在心肌供血與心肌細胞有氧代謝過程中發揮重要作用[11]。相關研究表明，miR-486通過抑制靶基因表達促進磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)信號通路表達，進而抑制心肌纖維化并有效改善心室重構[12]。本研究通過qRT-PCR法檢測非瓣膜性心房顫動與竇性心律病人血漿miR-486表達水平，結果顯示研究組血漿miR-486表達水平低于對照組，說明非瓣膜性心房顫動病人血漿miR-486呈低表達水平。進一步分析miR-486與非瓣膜性心房顫動病人生化指標相關性，結果顯示miR-486與LAD、CRP呈負相關，與LDL-C、TC呈正相關，其中LDL-C、TC等生化指標與CRP水平異常與非瓣膜性心房顫動發生有關，且CRP水平隨著心力衰竭程度加重而升高[13-14]。提示miR-486可能參與心房顫動的發生及發展過程。本研究ROC分析結果顯示：miR-486診斷非瓣膜性心房顫動具有較高的診斷效率，提示血漿miR-486表達水平可能成為臨床早期診斷非瓣膜性心房顫動的生物標志物。

miR-150位于人類染色體19q13.33并參與體內較多疾病的發生過程，有研究表明膿毒癥病人外周血miR-150表達水平降低并促進靶基因腫瘤壞死因子-α與白細胞介素-10等含量增加，導致機體炎癥反應加重[15]。相關研究報道，miR-150不僅在心肌梗死病人表達異常，同時通過調控促凋亡基因(早期生長反應因子2)與p2x7r進而減少心肌細胞死亡并改善心功能[16]。miR-150通過調控靶基因c-Myb表達從而改善心肌梗死后心肌纖維化[17]。相關研究表明，miR-150在高糖誘導的心肌肥大病人體內低表達，p300呈高表達，同時miR-150可調控p300介導的心肌肥大[18]。本研究結果顯示，研究組血漿miR-150表達水平低于對照組，說明非瓣膜性心房顫動病人血漿miR-150呈低表達。進一步分析發現miR-150與LAD、CRP呈負相關，而與LDL-C、TC呈正相關，說明隨著疾病嚴重程度加重，miR-150表達水平降低，提示miR-150表達水平降低并促進靶基因表達水平升高進而促進病情發展。miR-150表達水平升高可降低靶基因表達進而抑制心肌纖維化或炎癥反應從而緩解病情。進一步分析miR-150對非瓣膜性心房顫動的診斷價值，結果顯示miR-150敏感度為82.56%，特異度為70.93%，截斷值為1.14，提示血漿miR-150表達水平可作為早期診斷非瓣膜性心房顫動的生物標志物。

本研究對miR-486與miR-150進行相關性分析，結果顯示非瓣膜性心房顫動病人血漿miR-486與miR-150呈正相關，說明兩者在心房顫動發生過程中發揮重要作用。Logistic多元回歸分析結果顯示：LAD、CRP、miR-486與miR-150表達水平均為非瓣膜性心房顫動發生的危險因素。本研究結果提示血漿miR-486與miR-150表達水平降低提示其可能發生非瓣膜性心房顫動，并均與病人臨床指標密切相關。

綜上所述，非瓣膜性心房顫動病人血漿miR-486與miR-150表達水平均降低，二者呈正相關并與非瓣膜性心房顫動發生、發展之間存在顯著相關性，可作為臨床早期診斷疾病發生的重要生物標志物。但本研究存在不足之處，關于miR-486與miR-150在非瓣膜性心房顫動發生過程中的具體作用機制需進一步研究。