急性腦梗死病人發病后脾臟體積變化及與血清炎性因子、T淋巴細胞的相關性分析

潘晶晶

目前急性腦梗死已成為我國致殘、致死的主要疾病之一，急性腦梗死的發生激活顱內免疫應答，引起大量炎性因子釋放，破壞血管內皮細胞連接緊密性，增加血腦屏障通透性[1-4]。一些淋巴細胞、炎性因子等通過受損血腦屏障進入腦實質，從而進一步加重腦損傷。脾臟作為外周免疫器官，在生理或病理應激刺激下，將免疫細胞、血小板等釋放至血液循環系統中，因其釋放的血小板體積大、活性強，引起血小板反應，嚴重影響缺血性腦血管疾病病人預后[5-6]。有文獻報道，血小板高反應性(high on treatment platelet reactivity，HPR)卒中病人預后較差，且多出現復發[7-8]。動物實驗研究發現，出現腦缺血后，脾臟大量釋放免疫細胞和炎性因子進入體液循環中，自身體積出現縮小[9]。有文獻報道，脾臟切除將大大降低體液循環中淋巴細胞和炎性因子數量，從而阻止T淋巴細胞信號因子傳遞，進而發揮腦保護作用[10]。本研究觀察急性腦梗死發生后脾臟體積變化特點，并探討其與炎性因子、T淋巴細胞的關系，以期為急性腦梗死在免疫學上的治療提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 資料收集 選取2016年1月—2018年1月發病24 h內入住我院的急性腦梗死病人作為研究對象。納入標準：經頭顱CT/MRI檢查符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[11]中的急性腦梗死診斷標準；發病24 h內入院就診，且美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評分>5分[12]；年齡≥18歲；根據急性腦卒中TOAST分型明確為動脈粥樣硬化型腦梗死、心源型腦梗死或小動脈閉塞型腦梗死；入院前服用阿司匹林7 d以上。排除標準：伴有癲癇或急性心肌梗死病人；伴有腫瘤、自身免疫疾病或血液疾病病人；長期服用免疫抑制劑病人；伴有泌尿系統、肺部感染病人；伴有心、肺、腹部嚴重疾病，不能配合完成各項檢查病人。最終納入符合納入和排除標準病人63例，其中陳舊性腦梗死13例；陳舊性心肌梗死13例；入院時NIHSS評分(9.07±3.25)分；入院后NIHSS評分(7.09±3.18)分；梗死部位：大腦半球25例，后循環19例，基底節14例；梗死類型：大動脈粥樣硬化36例，心源性腦梗死10例，穿支動脈17例。選擇同期與急性腦梗死病人基本資料匹配的非急性腦梗死病人30例作為對照組，年齡≥18歲，入院前服用阿司匹林7 d以上，伴有至少兩項腦血管疾病危險因素，如：高血壓、糖尿病、吸煙和飲酒等。排除標準同急性腦梗死組。所有入選病人均簽署知情同意書，且本研究經醫院倫理委員會同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集病人基本資料(姓名、性別、年齡、身高、體重)、既往病史(高血壓、糖尿病、心臟疾病、卒中病史、高脂血癥等)、藥物使用情況、個人嗜好(吸煙、飲酒)、家族史、實驗室檢查(血常規、血糖、血脂、肝腎功能、凝血)、影像學資料(頭顱CT/MRI、頭頸血管彩色超聲/磁共振血管造影)。

1.2.2 脾臟體積測量 急性腦梗死病人入院時，發病36 h、3 d和5 d，參照文獻[13]方法使用彩超測量脾臟體積，即病人平臥休息10 min，之后取右側臥位，探頭平行肋間隙，二維聲像圖上清晰顯示脾臟體積調整至脾門切面(厚度最大切面)，測量脾臟長徑(a)和厚徑(b)，之后轉動探頭垂直于肋間隙測量寬徑(c)，脾臟體積(V)=a×b×c×π/6。彩超型號：Philips iu-22，探頭設置為“Abdomen”，頻率為2～5 MHz。同時測量對照組脾臟體積確定脾臟基線，本研究彩超測量均由同一位醫師完成。

1.2.3 血清炎性因子血清干擾素-γ檢測 采用酶聯免疫試劑盒(ELSIA)檢測血清干擾素-γ，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測，試劑盒購自賽默飛生物有限公司。

1.2.4 T淋巴細胞檢測 采集肘靜脈血3 mL，充分搖勻，采用流式細胞儀檢測T淋巴細胞，即取100 μL抗凝血加入至上樣管中，充分混勻，之后分別加入熒光素標記的抗體20 μL(異硫氰酸熒光素標記的抗CD4單克隆抗體、藻紅蛋白標記的抗CD8單克隆抗體、葉綠素蛋白標記的抗CD19單克隆抗體、藻紅蛋白標記的CD56單克隆抗體)，同時進行陰性對照，渦旋混勻，避光室溫孕育20 min，之后分別加入2 mL經10倍稀釋的破紅細胞低滲液，渦旋混勻，避光室溫孕育10 min，之后離心棄上清液，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗3次，最后懸浮于5 mL的PBS中，采用流式細胞儀檢測CD4T、CD8T、CD19B、CD6自然殺傷淋巴細胞百分比，計算相應絕對值。

1.2.5 血小板反應性檢測 采用PL-12血小板功能分析儀檢測血小板最大聚集率(AA-MAR)。細胞檢測同時，抽取肘靜脈血6 mL，注入660 μL、3.8%的枸櫞酸鈉專用管中搖勻，取0.3 mL至PL-12檢測管中自動檢測。獲得基礎數值后，加入25 μL的誘聚劑AA，連續間隔2 min得到標本中血小板計數，得到最低血小板計數時結果自動換算。最大血小板聚集率(%)=(基礎血小板數平均值-最低血小板數)/基礎血小板數平均值×100%。

2 結 果

2.1 兩組臨床資料比較(見表1)

表1 兩組臨床資料比較

2.2 對照組和急性腦梗死組不同時間脾臟體積和淋巴細胞變化 急性腦梗死病人脾臟體積先縮小后增大。與對照組比較，急性腦梗死病人發病24h內和36 h脾臟體積縮小，且36 h脾臟體積小于24 h脾臟體積，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，發病3d和5d脾臟體積增大，且5d脾臟體積大于3 d脾臟體積，差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，急性腦梗死病人發病24h內、36h、3d和5 d時T4淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；其中發病36 h三種淋巴細胞水平高于發病24 h內，而發病36 h后隨著時間延長，三種淋巴細胞水平不斷升高，差異無統計學意義(P>0.05)。T8淋巴細胞不同時間呈升高趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 對照組和急性腦梗死組不同時間脾臟體積、淋巴細胞變化(±s)

2.3 對照組和急性腦梗死組不同時間AA-MAR和血清干擾素-γ變化 急性腦梗死病人發病24 h內、36 h、3 d和5 d AA-MAR和血清干擾素-γ于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，發病36 h AA-MAR和血清干擾素-γ水平高于發病24h內，差異有統計學意義(P<0.05)。發病3 d AA-MAR和血清干擾素-γ水平出現下降，與發病36h比較差異無統計學意義(P>0.05)；發病5 d AA-MAR和血清干擾素-γ水平低于發病3d，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 對照組和急性腦梗死組不同時間AA-MAR和血清干擾素-γ變化(±s)

2.4 急性腦梗死病人不同時間脾臟體積與淋巴細胞水平、血小板反應性、炎性因子的相關性分析 急性腦梗死病人發病24 h內和發病36 h，T4淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞與脾臟體積呈負相關，發病3 d和5 d未發現相關性。不同時間T8淋巴細胞和脾臟體積無相關性。發病24h內、36h和3d時，AA-MAR、干擾素-γ與脾臟體積均呈負相關，而發病5 d均未發現相關性。詳見表4。

表4 急性腦梗死病人不同時間脾臟體積與淋巴細胞水平、血小板反應性、炎性因子的相關性分析

3 討 論

動物和臨床試驗均已證明免疫炎癥反應加重缺血性腦損傷，但其具體作用機制未見明確報道。本研究發現急性腦梗死急性期脾臟體積先縮小后變大，淋巴細胞發生相應變化，與已有文獻報道[13]結果一致。本研究還發現急性腦梗死急性期AA-MAR發生相應變化，提示急性腦梗死發病后脾臟通過釋放血小板、炎性因子及淋巴細胞等加重病人病情。

國外學者通過構建腦卒中動物模型，結果發現腦卒中后脾臟體積出現明顯縮小，重量減輕，且在發病2 d時達到最小，隨后開始變大，發病4 d時恢復正常[9]。本研究選取發病24 h內、36 h、3 d和5 d 4個時間對急性腦梗死病人脾臟體積進行測量，結果顯示發病24 h內，病人脾臟體積和對照組比較出現縮小，發病36 h脾臟體積最小，發病3 d時脾臟體積大于對照組，發病5 d時脾臟體積最大，與上述研究結果一致。Seifert等[9]采用大腦動脈閉塞構建卒中模型，并采用羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標記脾臟細胞，發現脾臟體積減小，循環中被標記的脾臟細胞增多，推測可能與脾臟體積減小有關。有學者認為，脾臟體積縮小與交感神經系統激活有關，因脾被膜的α1腎上腺素激活后，刺激脾被膜平滑肌收縮，從而引起脾臟體積減小[15]。

本研究發現急性腦梗死發生后4個時間干擾素-γ呈先升高后降低趨勢。動物實驗研究發現，通過大腦動脈閉塞構建卒中模型后，循環中干擾素-γ先升高后恢復正常，但與本研究達到峰值時間不同，可能與大腦動脈閉塞構建卒中時間有關[13-14]。本研究通過相關性分析結果發現，干擾素-γ與脾臟體積呈負相關，且隨著脾臟體積波動而變化。有研究發現，脾臟切除大腦動脈閉塞構建卒中模型腦梗死病灶內干擾素-γ水平低于未切除脾臟卒中模型，腦梗死病灶體積更大，注射重組干擾素-γ后，梗死體積明顯增大，提示干擾素-γ抵抗脾臟切除的神經保護作用[16]。結合本研究結果認為，脾臟可能通過產生或釋放干擾素-γ等炎性因子參與腦卒中損傷，其具體作用機制需進一步探討。

有文獻報道，腦缺血后機體固有免疫吸引大量淋巴細胞進入顱內，促進炎性反應，直接損傷神經細胞，進而加重卒中損傷[17]。本研究發現在急性腦梗死發生后T4淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞增多，且在發病36 h與脾臟體積呈負相關，而不同時間T8細胞與脾臟體積未見相關性。脾臟作為重要的免疫器官，含有大量淋巴細胞，在循環中被抗原激活離開脾臟。有研究發現，腦卒中發生后外周血淋巴細胞明顯增加，其與脾臟體積呈負相關，但未進行淋巴亞群分析[18]。Seifert等[9]采用CFSE標記脾臟細胞發現被釋放進循環，進入病灶，這些細胞最終證實為自然殺傷細胞、T淋巴細胞和單個核細胞。本研究證實淋巴細胞與脾臟體積相關，進一步驗證脾臟通過釋放淋巴細胞參與急性腦梗死損傷的推論，并明確參與損傷的細胞主要為T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷淋巴細胞。

本研究結果發現，腦卒中后血小板AA-MAR增強，且其變化與脾臟體積存在相關性。有文獻報道，抗栓治療后HPR是卒中病人預后和復發的獨立危險因素[7]。臨床中多采用血小板聚集率反映血小板反應，血小板平均體積越大，其反應性越高。有學者發現，脾臟內血小板體積大于循環中血小板，而心肌梗死后循環中血小板體積進一步增大，血小板反應性增高，當脾臟切除后，抵抗血小板反應性[6]。目前脾臟釋放血小板和血小板被激活的作用機制未有明確報道，有學者認為其可能與兒茶酚胺升高有關[19]。因此，關注缺血誘導的脾臟釋放體積較大的高反應性血小板，是治療急性腦梗死的重要途徑之一。

目前臨床已證實在溶栓時間窗內聯合應用芬戈莫德和阿替普酶可明顯減小腦梗死面積，改善病人預后，且未增加不良反應發生[20]。有文獻報道，發病4.5 h后給予芬戈莫德，主要抑制淋巴細胞釋放，減輕腦損傷程度，促進病情恢復[21]。有學者構建動物卒中模型后注射多能成體祖細胞，抑制脾臟釋放淋巴細胞，從而減輕免疫損傷，改善預后[22]。脾臟參與急性腦梗死免疫應答的部分機制，血小板、淋巴細胞及炎性因子均有可能成為急性腦梗死治療的新靶點。