傣藥雙姜胃痛丸對(duì)小鼠的鎮(zhèn)痛作用研究

李寶晶 王 亭

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 昆明 650500

雙姜胃痛丸為傣藥成藥，其組方被列為傣醫(yī)的經(jīng)典藥方。全方由毫命(姜黃CurcumalongaLinn.)、補(bǔ)累(紫色姜ZingiberpurpureumRosc.)、波波罕(地不容StephaniaepigaeaH.S. Lo)、罕好帕(石菖蒲AcorustatarinowiiSchott)、反帕嘎[苦菜子Brassicaintegrifolia(West)O. E. Schulz]組成。其中姜黃、紫色姜性溫?zé)幔腼L(fēng)、土塔，具有通氣消脹、活血止痛之功，為主藥；石菖蒲性熱，入風(fēng)、水、土塔，主治脘腹脹痛，不思飲食，為輔助藥；地不容、苦菜子味苦，性涼，既有涼血止痛之功，還可抑制主藥之燥性，為抑制藥[1]。在功能主治方面，傣醫(yī)認(rèn)為雙姜胃痛丸能“通塞勒，塞攏，補(bǔ)塔鈴。兵接崩接短，短嘎習(xí)不利惡來”，即“理氣止痛，和胃降逆”，主治中焦氣滯所致胃脘痞滿脹痛，噯氣吞酸，以及慢性淺表性胃炎見上述證候者[2]。本研究采用熱板法和甲醛足底注射致痛法，研究雙姜胃痛丸全方的鎮(zhèn)痛作用，并探討其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，SPF級(jí)，雌雄均有，體重18～22 g，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(川)2013-24。實(shí)驗(yàn)用小鼠飼料及墊料，購自湖南斯萊克景達(dá)生物科技有限公司，許可證號(hào)：2016-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)駐動(dòng)物飼養(yǎng)房后，實(shí)驗(yàn)室條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)方法及條件經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)審查合格。

1.2 試劑和儀器 雙姜胃痛丸(西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：170117)。20倍體積75%乙醇浸泡過夜后充分研磨，濾去殘?jiān)占癁V液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后減壓干燥，4 ℃保存，用前以0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制。阿司匹林腸溶片(50 mg，湖南亞大制藥有限公司，批號(hào)：20160401)，用前以0.5% CMC-Na配制。腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(20190520)、5-羥色胺(HT)檢測(cè)試劑盒(20190422)、前列腺素(PG)E2(20190710)、谷氨酸(Glu)(20190515)檢測(cè)試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

電子天平(ALC2104，北京賽多利斯天平有限公司)，酶標(biāo)儀(1500，Thermo Fisher)，智能熱板儀(RB-200，成都泰盟科技有限公司)，型恒溫水浴鍋(HH-6，國華電器有限公司)，MyCycler PCR儀、MyiQ梯度單色實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-Rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) ① 熱板法：取雌性小鼠40只，隨機(jī)分成空白組(0.5% CMC-Na)、陽性對(duì)照組(阿司匹林，0.2 g/kg)和SJWT低、中、高劑量組(0.75 g生藥/kg、1.50 g生藥/kg、3.00 g生藥/kg)共5組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前測(cè)定各組小鼠給藥前痛閾值即基礎(chǔ)痛閾值。實(shí)驗(yàn)開始每天灌胃給藥1次，連續(xù)7天。末次給藥后30、60、90min分別測(cè)定各鼠的痛閾值1次。超過60 s 未出現(xiàn)痛反應(yīng)者，即刻停止實(shí)驗(yàn)，痛閾值以 60 s 計(jì)算。

② 甲醛致痛法：取小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分成空白組(0.5% CMC-Na)、模型組(0.5% CMC-Na)、陽性對(duì)照組(阿司匹林，0.2 g/kg)和雙姜胃痛丸低、中、高劑量組(0.75 g生藥/kg、1.50 g生藥/kg、3.00 g生藥/kg)共6組，每組8只。末次給藥后2 h，除空白組外，各組小鼠右后足底行皮下注射以2.5%甲醛溶液25 μL/只。注射后將小鼠置 2000 ml燒杯中，分兩個(gè)時(shí)相(Ⅰ相，0～5 min，早發(fā)相)和(Ⅱ相，10～30 min，遲發(fā)相)觀察記錄小鼠舔、咬右后足的累計(jì)時(shí)間并計(jì)算疼痛抑制率。疼痛抑制率=(模型組舔足累計(jì)時(shí)間-給藥組舔足累計(jì)時(shí)間)/模型組舔足累計(jì)時(shí)間×100%。

1.3.2 鎮(zhèn)痛機(jī)制研究 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)②觀察結(jié)束后處死小鼠，取腦組織和右后足，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒∈竽X組織，加生理鹽水制成10%勻漿液，4 ℃，3000 rpm離心10 min，取上清液，按檢測(cè)試劑盒使用說明，測(cè)定5-HT和Glu含量。分離小鼠右后足組織，冰上剪碎，取適量組織加生理鹽水勻漿，4 ℃，3000 rpm離心10 min，取上清液，測(cè)定PGE2和TNF-α含量。

另取右后足組織適量，Trizol試劑一步法提取總RNA，采用20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，42 ℃溫育60 min，70 ℃加熱10 min后終止反應(yīng)，冰浴冷卻，得cDNA第一鏈。采用SYBR green PCR試劑盒，優(yōu)化反應(yīng)條件：預(yù)變性，50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；變性，95 ℃，15 s；退火/延伸，60 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95 ℃：15 s；60 ℃：30 s；95 ℃：15 s。反應(yīng)結(jié)束，提取各基因Ct值，2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。MCP-1引物根據(jù)PubMed查詢對(duì)應(yīng)物種目的基因mRNA序列，以CDS序列設(shè)計(jì)，序列見表1。

表1 引物序列

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 雙姜胃痛丸對(duì)熱刺激小鼠痛閾的影響 灌胃給藥1周后，阿司匹林在末次給藥后30 min、60 min能顯著提高小鼠熱刺激體表的痛閾值；雙姜胃痛丸在末次給藥后60 min能顯著提高小鼠熱刺激體表的痛閾值。具體見表2。

2.2 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠痛反應(yīng)的影響 右后足底注射甲醛后，模型組小鼠出現(xiàn)明顯舔足、咬足反應(yīng)。與模型組相比，阿司匹林組及雙姜胃痛丸高劑量組小鼠Ⅰ時(shí)相舔足、咬足累計(jì)時(shí)間減少，疼痛抑制率增加；阿司匹林組及雙姜胃痛丸低、中、高劑量組小鼠Ⅱ時(shí)相舔足、咬足累計(jì)時(shí)間均顯著減少，疼痛抑制率增加，且雙姜胃痛丸的作用表現(xiàn)出劑量依賴性。具體見表3。

表2 雙姜胃痛丸對(duì)熱刺激小鼠痛閾的影響

表3 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠痛反應(yīng)的影響

2.3 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠炎癥反應(yīng)的影響 對(duì)小鼠甲醛注射足組織中炎性因子含量的研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，甲醛注射模型組小鼠足組織中TNF-α和PGE2含量顯著升高，MCP-1 mRNA表達(dá)量顯著升高。阿司匹林和雙姜胃痛丸中、高劑量均能顯著降低甲醛注射足組織中TNF-α含量，阿司匹林和雙姜胃痛丸低、中、高劑量均能顯著降低甲醛注射足組織中PGE2含量和MCP-1mRNA表達(dá)量，且雙姜胃痛丸的作用表現(xiàn)出劑量依賴性。具體見表4。

表4 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠炎癥反應(yīng)的影響

2.4 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠腦組織疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響 對(duì)甲醛致痛小鼠腦組織疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)含量的結(jié)果見表5。結(jié)果顯示， 甲醛致痛模型小鼠腦組織中5-HT含量較對(duì)照組升高，雙姜胃痛丸高劑量對(duì)小鼠腦組織5-HT的含量有上調(diào)趨勢(shì)，但無顯著性差異。甲醛致痛小鼠腦組織中Glu含量與對(duì)照組相比無顯著性差異，雙姜胃痛丸各劑量對(duì)Glu含量無顯著影響。阿司匹林對(duì)小鼠腦組織中5-HT和Glu含量均無明顯影響。具體見表5。

表5 雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠腦組織疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

3 討論

傣藥經(jīng)方雙姜胃痛丸由姜黃、紫色姜、地不容、石菖蒲、苦菜子組成，全方可理氣止痛，和胃降逆。已有的研究證實(shí)，姜黃及其主要活性成分姜黃素[3-4]，地不容及其主要活性部位總生物堿[5-6]，均有確切的抗炎鎮(zhèn)痛作用，但關(guān)于全方鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制的鮮有系統(tǒng)報(bào)道[7]。本研究分別選取熱板法復(fù)制經(jīng)典熱刺激致痛模型，選取甲醛足底注射致痛法模擬急性組織損傷所致的持續(xù)性炎性疼痛，考察雙姜胃痛丸的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制。其中，甲醛致痛模型Ⅰ相反應(yīng)由于直接刺激外周神經(jīng)所致，而Ⅱ相反應(yīng)則主要由炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放所致[8]。研究發(fā)現(xiàn)，雙姜胃痛丸中劑量能提高熱刺激小鼠的痛閾值，高劑量能縮短甲醛致痛小鼠的Ⅰ相舔、咬足時(shí)間，疼痛抑制率為28.38%；低、中、高劑量組均能顯著縮短甲醛致痛小鼠的Ⅱ相舔、咬足時(shí)間，疼痛抑制率分別為21.39%、27.02%和42.42%，提示雙姜胃痛丸既能通過抑制神經(jīng)系統(tǒng)的活動(dòng)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)，也能抑制炎癥反應(yīng)引發(fā)的炎性疼痛，且后者作用優(yōu)于前者。

炎性疼痛可由創(chuàng)傷、感染、化學(xué)刺激(如甲醛、醋酸)、外科手術(shù)操作等導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)所引發(fā)。在此過程中，包括粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞活化并表達(dá)、釋放出細(xì)胞因子、趨化因子及其他生理活性物質(zhì)，如白介素(IL)-6、IL-1、TNF-α、MCP-1、PGE2等。其中，TNF-α和PGE2既是炎癥介質(zhì)，又是致痛物質(zhì)，且PGE2增加可引起痛覺過敏和痛覺超敏發(fā)生[9-10]。趨化因子超家族成員MCP-1在炎癥反應(yīng)過程中大量產(chǎn)生，可通過誘導(dǎo)中樞敏化，在炎性疼痛的產(chǎn)生和維持過程發(fā)揮重要作用，對(duì)大鼠痛覺行為有易化作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，雙姜胃痛丸可明顯降低小鼠甲醛注射后足組織中PGE2含量、TNF-α含量和MCP-1mRNA表達(dá)水平，提示雙姜胃痛丸對(duì)甲醛致痛小鼠的Ⅱ相疼痛反應(yīng)的抑制作用，與減少炎癥介質(zhì)、致痛物質(zhì)及痛覺易化物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放有關(guān)。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)均參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的鎮(zhèn)痛行為，前者以5-HT、多巴胺等為代表，后者主要包含以Glu為代表的興奮性氨基酸和以γ-氨基丁酸為代表的抑制性氨基酸[12-13]。本研究表明，雙姜胃痛丸各劑量對(duì)小鼠大腦組織中5-HT和Glu含量無明顯影響。

綜上所述，雙姜胃痛丸對(duì)熱刺激致痛、甲醛致痛模型Ⅰ相疼痛反應(yīng)和Ⅱ相疼痛反應(yīng)均表現(xiàn)出鎮(zhèn)痛作用，相同劑量下對(duì)甲醛注射引起的Ⅱ相疼痛反應(yīng)的鎮(zhèn)痛作用最強(qiáng)。在甲醛致痛模型，雙姜胃痛丸顯著降低甲醛注射組織中炎癥介質(zhì)、致痛物質(zhì)PGE2和TNF-α含量，降低疼痛易化介質(zhì)MCP-1的表達(dá)，而對(duì)腦組織中與中樞鎮(zhèn)痛相關(guān)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu均無明顯影響，提示雙姜胃痛丸的鎮(zhèn)痛作用與減少炎癥介質(zhì)、致痛物質(zhì)及痛覺易化物質(zhì)的釋放有關(guān)；雙姜胃痛丸的鎮(zhèn)痛作用是否會(huì)在更高劑量表現(xiàn)出對(duì)熱刺激致痛及甲醛的致痛模型Ⅰ相反應(yīng)階段表現(xiàn)出劑量依賴性，以及其可能的作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究。