三種滇西地區藥用黃芩屬植物與正品黃芩抗菌活性研究

刁紅梅 吳秀蓉 肖朝江 姜 北

大理大學藥物研究所，云南 大理 671000

黃芩屬(ScutellariaLinn.)植物種類繁多，部分有藥用記載，多用于清熱解毒、抗菌消炎[1]，其中黃芩(Scutellariabaicalensis)作為正品中藥材主要分布在東北、華北、西北地區東部[1]。在上述地區之外，一些當地分布的黃芩屬植物也常作為黃芩代用品藥用，特別是西南地區黃芩屬植物種類多、資源豐富，黃芩代用品現象更加常見，如滇黃芩(S.amoena)在《滇南本草》中便明確可以代黃芩藥用。在云南滇西地區，當地納西族、彝族、白族等少數民族也有用滇黃芩(S.amoena)(白語亦稱作“黃芩”)、麗江黃芩(S.likiangensis)(納西語“shidailaiki”)、半枝蓮(S.barbata)(白語“奢每粗”)等代替正品黃芩藥用的傳統[1]。根據《中國植物志》，黃芩、滇黃芩、麗江黃芩均為黃芩屬黃芩亞屬頂序黃芩組狹葉黃芩亞組植物[1]，在植物分類學上具有較高的近緣性與相似度，因此滇黃芩、麗江黃芩作為黃芩的代用品具有一定的植物分類學基礎，但半枝蓮在植物分類學上與黃芩相隔較遠[1]，因此，是否可以代用存在一定的疑問。另一方面，黃芩屬植物資源雖然十分豐富，但現代研究常限于幾種常見的藥用植物，許多代用品在化學成分、藥理藥效方面研究很少，因此，無法系統評估這些植物潛在的應用價值與替代黃芩藥用的合理性。為此，本課題對采自滇西地區三種常見黃芩屬藥用植物滇黃芩、麗江黃芩、半枝蓮以及市售正品中藥材黃芩進行了抗菌活性對比性研究，為認識這幾種黃芩屬植物與黃芩替代使用可行性、科學合理地開發滇西黃芩屬植物資源提供初步的基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 供試樣品 滇黃芩、半枝蓮植物樣品2019年7月采自云南省大理州洱源縣；麗江黃芩植物樣品2019年8月采自麗江玉龍縣。經大理大學生藥學教研室張德全博士鑒定為滇黃芩(Scutellaria amoena C. H. Wright)、半枝蓮(Scutellaria barbata D. Don)和麗江黃芩(Scutellaria likiangensis Diels)。正品黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)2019年8月購自大理市當地藥店。上述四種樣品的地下部分各約10 g，粉碎后分別以85%乙醇200 mL冷浸提取3次，每次24 h，再以超聲提取2次，每次30 min，合并提取液，減壓濃縮，凍干，分別得樣品粗提物凍干粉。

1.2 供試菌種 實驗所用金黃色葡萄球菌(批號：ATCC 25923)、痢疾桿菌(批號：ATCC 25927)、大腸桿菌(批號：ATCC 25922)均由大理大學基礎醫學院病原生物學綜合實驗室提供。

1.3 試劑與儀器 甲醇(賽默飛世爾科技中國有限公司，色譜純)，甲酸(天津市化學試劑三廠，分析純)，實驗用水為哇哈哈純凈水。EL204型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，SB25-12 DTDN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，RE-5205型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)，多功能酶標儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 培養基配制 LB液體培養基(牛肉膏蛋白胨液體培養基)：取100 mL去離子水，加入洗凈的攪拌子，置磁力攪拌機上，依次加入胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 2 g，溶質全部溶解后加去離子水至200 mL，轉入錐形瓶，封口。經121℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min，烘干后冷卻備用。LB固體培養基(牛肉膏蛋白胨固體培養基)：取100 mL去離子水，加入洗凈的攪拌子，置磁力攪拌機上，依次加入胰蛋白胨2 g、酵母提取物1 g、NaCl 2 g、瓊脂粉4 g，攪拌均勻后加去離子水至200 mL，轉入錐形瓶，封口。經121℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌30 min，烘干后冷卻至50～60℃，倒制平板。

1.4.2 菌液制備 在超凈工作臺上，將金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、大腸桿菌以三區劃線法接種在相應的LB固體平板上，每個菌種接種2個平板，置28℃恒溫培養箱中培養36 h后，挑取單個菌落置LB液體培養基中，置27℃搖床(160 rpm)培養6～8 h，菌液渾濁后以LB液體培養基稀釋10000倍，即成病原菌稀釋液(約為1.0×104 CFU/mL)。

1.4.3 供試品溶液配制 以上4種樣品粗提物各稱取24 mg，溶于6 mL無菌水中，以0.22 μm微孔濾膜除菌，將供試品配置成初始濃度為4 mg/mL儲備液，取儲備液，以無菌水系列稀釋。

1.4.4 實驗操作 在滅菌96孔板上，每個樣品濃度平行加4個復孔，分別取50 μL供試品溶液及50 μL菌液混勻，使各孔最終體積為100 μL，同時做空白對照(50 μL LB液體培養基+50 μL菌懸液)、空白培養基對照(100 μL LB液體培養基)，將96孔板置28℃培養箱中培養15～18 h后，用酶標儀檢測各孔OD600 nm值。

供試品對大腸桿菌及痢疾桿菌的終濃度為：2.00、1.50、1.00、0.75、0.50 mg/mL，對金黃色葡萄球菌的終濃度為：0.50、0.40、0.30、0.20、0.10 mg/mL。

根據OD600 nm值，計算各濃度下樣品對細菌的生長抑制率，計算公式如下：

細菌的生長抑制率% =(空白對照OD600值 - 供試品OD600值)/空白對照OD600 值×100%

以樣品濃度為橫坐標，各濃度下抑菌率的均值為縱坐標繪制回歸曲線，根據回歸曲線計算當抑制率為50%時的樣品濃度，即IC50值。

1.4.5 供試樣品HPLC分析 上述4種樣品粗提物各取30 mg，以2 mL色譜級甲醇超聲溶解，0.45 μm濾膜過濾，配制成濃度為15 mg/mL供試樣品溶液。HPLC分析條件為：分離柱為Agilent SN USCM052204 SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)；梯度洗脫：0～10 min，5%～25%(B)；10～90 min，25%～65%(B)；90～100 min，65%～100%(B)；100～105 min，100%(B)；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長為254 nm。

2 實驗結果

2.1 四種供試黃芩屬植物樣品的抗菌活性 四種黃芩屬植物供試樣品對各菌種的生長抑制活性實驗結果如表1、表2所示，四種黃芩屬植物對各菌種的生長抑制率曲線如圖1所示。根據抗菌活性實驗結果，四種黃芩屬植物供試樣品對大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的生長均有抑制作用。以IC50值為依據，各供試樣品對痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制活性明顯，對大腸桿菌的生長抑制作用稍弱；同時，滇黃芩、麗江黃芩對痢疾桿菌的生長抑制作用顯著優于黃芩、半枝蓮。總體來看，三種滇西地區黃芩屬植物樣品抑菌活性優于市售正品黃芩樣品。

表1 四種黃芩屬植物對大腸桿菌、痢疾桿菌的抑制率

表2 四種黃芩屬植物對金黃色葡萄球菌的抑制率

(A)大腸桿菌；(B)痢疾桿菌；(C)金黃色葡萄球菌圖1 四種黃芩屬植物供試樣品對各菌種的生長抑制曲線

2.2 四種供試黃芩屬植物樣品HPLC分析結果 四種黃芩屬植物樣品的HPLC分析結果如圖2所示。根據HPLC分析結果，滇黃芩與麗江黃芩的主要化學成分較為相似，僅在9號峰上兩者有一定的差異，顯示麗江黃芩的化學成分更具多樣性。同時滇黃芩與麗江黃芩的主要化學成分均較正品黃芩豐富，特別是含有正品黃芩中未見的3號峰，同時，5、6號峰的含量也遠遠大于正品黃芩，僅在7號峰上與正品黃芩有所不同。根據上述譜峰的UV譜圖(圖3)，3、5、6、7號峰具有十分相似的UV譜圖，顯示這些譜峰應來自同一類型的黃芩屬植物所含有的黃酮類成分[2-7]，應該是黃芩屬植物抗菌消炎等藥用功效的主要物質基礎，由此推斷滇黃芩與麗江黃可能具有較正品黃芩更好的功效與品質。

HPLC分析結果顯示(圖2)，半枝蓮與其它三種黃芩屬植物樣品的主要成分組成有較大差異，相關譜峰的UV譜圖(圖3)也顯示其主成分9號峰與黃芩屬植物含有的黃酮類成分在結構類型上有一定的差異，因此，半枝蓮在抗菌活性以及藥用記載上與滇黃芩、麗江黃芩等有所不同也屬合理。

圖2 四種黃芩屬植物供試樣品的HPLC譜圖(254 nm)

圖3 HPLC譜圖中幾個主要譜峰的UV譜圖

3 討論

黃芩屬植物我國南北均產，除正品黃芩(S.baicalensis)藥用外，據《新編中藥志》記載，另有甘肅黃芩(S.rehderiana)、粘毛黃芩(S.viscidula)、滇黃芩(S.amoena)、麗江黃芩(S.likiangensis)、連翹葉黃芩(川黃芩)(S.hypericifolia)等5種黃芩屬植物在各地亦做黃芩藥用。根據《中國植物志》，這5種黃芩屬植物外加正品黃芩均為黃芩屬黃芩亞屬頂序黃芩組狹葉黃芩亞組植物，應該并非巧合。前人曾采用聚類分析[8]、主成分分析[9]、數量分類[10]等方法分析了正品黃芩與非正品黃芩間的關系，均證明這幾種黃芩屬植物與正品黃芩的親緣關系十分接[11-12]，因此這幾種黃芩代用品從植物分類學角度來看應該具有一定的合理性，但在化學成分與藥理藥效學研究方面缺乏系統的研究報道。

根據文獻報道，正品黃芩對大腸桿菌、痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制活性[2-7]，為此，本研究特意選取這三種致病菌用以探討三種滇西地區黃芩屬植物與正品黃芩的抗菌活性差異。實驗結果顯示，滇黃芩與麗江黃芩化學成分最為相近，兩者對大腸桿菌以及痢疾桿菌的抑制活性也十分相似，均與滇黃芩與麗江黃芩在植物分類學上親緣關系最為接近完全吻合。滇黃芩、麗江黃芩較正品黃芩的化學成分更為豐富，含有正品黃芩中未見的3號峰，同時，5、6號峰的含量也遠遠大于正品黃芩，故滇黃芩、麗江黃芩的抑菌活性也往往優于正品黃芩。而半枝蓮與其它幾種供試黃芩屬植物樣品的親緣關系較遠且化學成分相差較大，對幾種菌種的抑制活性也確實與滇黃芩、麗江黃芩不同，但半枝蓮卻仍表現出一定的抑菌活性，其作用機制還有待進一步研究。本研究為基于傳統植物分類學尋找、開發藥用植物資源、挖掘民族醫藥潛力提供了一個研究例證。

綜合而言，滇黃芩、麗江黃芩在抑菌活性方面優于正品黃芩，且化學成分較正品黃芩類型相似、內容更加豐富，初步證實了這幾種黃芩屬植物具有替代正品黃芩藥用的合理性。滇西地區黃芩屬植物資源豐富，本研究為深入認識滇西地區黃芩屬植物品質、科學合理地開發滇西黃芩屬植物資源提供了初步的實驗依據。