民族藥水三七質量標準的提升研究

鄧 桃 楊昌貴 周 濤 江維克* 許 斌

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市食品藥品檢驗檢測中心，貴州 貴陽 550002

水三七又名水田七、屈頭雞、水蘿卜等，為蒟蒻薯科植物裂果薯SchizocapsaplantagineaHance.的塊莖，水三七之名始載于《貴州衛生》[1]，在《廣西中藥志》《湖南藥物志》中均有記載，主要分布于貴州、湖南、廣西等省區，為苗族、侗族、水族、瑤族等民族習用藥物，用于百日咳、食積、胃痛、跌打損傷、咽喉腫痛的治療[2]。現代藥理和臨床應用表明，水三七具有很好的抗腫瘤作用。2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》和2014年版《廣西瑤族習用藥材質量標準》等標準中[3-5]均僅收載了水三七藥材的來源、性狀等簡單的質控項目，缺少專屬的鑒別方法和藥效成分定量測定方法，這難以控制藥材質量。因此，建立更為完善的水三七藥材質量控制標準，顯得非常有必要。

水三七主要化學成分為甾族皂苷、氨基酸、黃酮和花青色素[6]以及多種甾苦味物質[7]，其中總皂苷為其抗腫瘤的主要活性成分，能明顯抑制食管癌細胞、胃癌細胞和肝癌細胞的生長[8-11]。因此，本文以總皂苷作為水三七含量測定的指標成分。通過參考相關文獻[5,12]，對顯微鑒別、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和總皂苷含量測定進行研究，并對17批水三七藥材進行測定，制定了合理的限度，為完善水三七質量控制標準提供了方法和依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器與試劑 紫外可見分光光度計(蘇州島津儀器有限公司，型號UV-2700)；型箱式電阻爐(天津市泰斯特儀器有限公司，型號SX-5-12)；電子分析天平(梅特勒科學儀器公司，型號EL104，分度值0.1 mg)。

人參皂苷Re對照品(成都埃法生物科技有限公司，批號52286-59-6，純度98 %)；冰醋酸(上海申博化工有限公司，批號1803101)、香草醛(天津科密歐化學試劑有限公司，批號20180510)、高氯酸(國藥集團化學試劑有限公司，批號20170113)、甲醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號20180802)、無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司，批號20180228)均為分析純。

1.2 藥材 水三七藥材采自貴州省羅甸、惠水、荔波、鎮遠4縣的不同鄉鎮，經貴州中醫藥大學生藥學教研室江維克教授鑒定為蒟蒻薯科植物裂果薯SchizocapsaplantagineaHance 的塊莖，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 粉末土黃色。淀粉粒類球形、半圓形、類三角形，直徑5～25 μm，臍點點狀、人字狀，復粒由2～3分粒組成；草酸鈣針晶散在或成束，長50～85 μm；螺紋導管可見，直徑8～30 μm。見圖1。

1、導管 2、淀粉粒 3、針晶圖1 水三七粉末顯微鑒別圖

2.2 水分、總灰分、酸不溶性灰分的檢查及醇浸出物的含量測定 參照2015年版《中國藥典》第四部通則0832、2302測定水分、總灰分及酸不溶性灰分的含量；醇浸出物測定參照2015年版《中國藥典》四部通則2201項下的熱浸法測定，以55 %乙醇為溶劑。所測17批藥材水分含量7.38%～8.79%，平均含量7.80%；總灰分含量3.26%～7.06%，平均含量3.89%；酸不溶性灰分含量0.45%～3.12%，平均含量0.72%；醇浸出物含量11.52%～22.32%，平均含量14.44%。結果見表3。

2.3 水三七總皂苷的含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re對照品18.6 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.744 mg/mL的人參皂苷Re對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 取水三七藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入70 %的乙醇25 mL，超聲處理90 min，濾過，濾液轉移至50 mL的容量瓶中，用提取液稀釋至刻度，即得。

2.3.3 顯色條件及檢測波長的選擇 分別精密量取0.2 mL“2.3.1”和“2.3.2”項下的對照品、供試品溶液于10 mL比色管中，90℃水浴蒸干溶劑，依次精密加入新配置的10%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.6 mL，搖勻，70℃水浴加熱20 min，取出，立即用水迅速冷卻至室溫，加冰醋酸5 mL，以隨行試劑為空白。在200 nm～800 nm范圍掃描，供試品和對照品均在545 nm處有最大吸收波長。

2.3.4 線性關系考察 精密吸取“2.3.1”項下的對照品溶液50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL，于10 mL比色管中，按“2.3.3”項下顯色，在545 nm測定各組吸光度。以濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.027843X+0.127869(r=0.9994)，表明人參皂苷Re在6.305 ～ 37.830 μg/mL范圍線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取6份“2.3.1”項下對照品溶液1 mL于比色管在，按“2.3.3”項下顯色，在545 nm測定各組吸光度，RSD值為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 精密稱取水三七藥材粉末6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下顯色法測定吸光度，并代入標準曲線計算含量，平均含量為2.70%，RSD值為2.39%，表明方法的重復性良好。

2.3.7 穩定性試驗 取“2.3.2”下供試品溶液，分別于室溫0 h、0.5 h、1 h、2 h、14 h、18 h按“2.3.3”項下方法測定吸光度，RSD值為1.75%，表明供試品溶液在18 h內穩定性良好。

表2 人參皂苷Re的回收率

2.3.8 加樣回收試驗 稱取已知含量的供試品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入2.23 mg/mL的人參皂苷Re對照品溶液3 mL，按“2.3.2”項下供試品制備方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下顯色法測定吸光度，計算回收率，回收率為95%～105%間，平均回收率為97.46%，RSD值為1.75%，結果見表2。

2.3.9 樣品檢測 取17批樣品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下顯色，在545 nm測定各組吸光度，計算各批次樣品中總皂苷的含量，測定總皂苷含量1.39%～4.56%，平均含量為2.23%，RSD值為37.82%，結果見表3。

3 討論

3.1 浸出物的測定 研究表明，水三七醇浸出物具有較好的抗腫瘤效果[8]，控制醇浸出物的含量，對確保藥材質量具有重要意義。本文考察了不同濃度的乙醇(55%、65%、75%、85%、95%)對浸出物含量的影響，發現55%乙醇作溶劑，浸出物的含量最高；比較了冷浸法和熱浸法的提取效果，發現熱浸法的提取效果較冷浸法好，且耗時短，故選擇以55%乙醇為提取溶劑，熱浸法測定含量。

3.2 總皂苷含量測定 水三七總皂苷為抗腫瘤的主要活性成分[9]，參考相關文獻[12]，筆者對水三七總皂苷的提取工藝、顯色條件進行了優選。提取溶劑考察發現70%甲醇和70%乙醇的提取率相對較高，且二者差異不顯著，考慮到乙醇毒性較甲醇小，故選擇70%乙醇作為提取溶劑。在此基礎上，考察了提取方法(超聲提取、回流提取)，提取時間(15～105 min)以及溶劑用量(10～70 倍量)對總皂苷含量的影響，結果表明50倍量的70%乙醇超聲提取90 min可將總皂苷提取完全，所建立的供試品制備方法相較文獻報道的水浴回流4小時提取，不僅節約時間，而且提取率高、操作簡便。顯色條件考察了不同水浴揮干溫度(70℃、80℃、90℃)對總皂苷含量的影響，發現揮干溫度對總皂苷含量無顯著性的影響，從節約時間的角度考慮，把水浴揮干溫度定為90℃，相較于文獻用70℃揮干溶劑，極大的節約了時間。接著對顯色劑濃度和用量、顯色溫度及時間分別進行了優選，結果表明采用10%香草醛-冰醋酸0.3 mL，高氯酸0.6 mL，在70℃下水浴20 min顯色，能充分反應，方法重復性良好。

3.3 限量標準制定 根據17批水三七藥材的實驗結果，水分、總灰分、酸不容性灰分按不高于平均值的120%制定標準限度，建議水分含量不得過9.0%，總灰分含量不得過5.0%，酸不溶性灰分含量不得過1.0%；浸出物、總皂苷按不低于平均值的80%制定標準限度，建議醇溶性浸出物含量不得少于12.0%，總皂苷含量以人參皂苷Re計，不得少于2.0%。

本文對水三七藥材質量標準進行了系統的研究，相較于已有標準[3]，增加了“顯微鑒別”、“水分”、“總灰分及酸不溶性灰分”、“浸出物”和“含量測定”等項。且建立的質量控制方法簡單易行，能夠準確、科學地評價水三七質量，為水三七藥材質量標準的提升提供了方法和依據。