不同施氮水平下棉花葉片最大羧化速率的高光譜估測

張鑫磊，劉連濤，孫紅春，張 科，白志英，董合忠，李存東，張永江※

（1. 河北農業大學農學院/省部共建華北作物改良與調控國家重點實驗室/河北省作物生長調控重點實驗室，保定 071001；2. 山東棉花研究中心，濟南 250100）

0 引 言

植被光合作用是生態系統物質循環最為重要的一個環節，是地球系統一切生命活動的物質基礎和能量來源[1]。植物光合作用對環境高度敏感，在多個環境因子的影響下，光合速率的準確模擬非常困難。在一些經典光合生理模型中，通常以葉片最大羧化速率（Maximum Carboxylation Rate，Vcmax）作為模擬光合作用的核心，因此葉片Vcmax的準確模擬對光合速率和植被生產力的預測至關重要[2]。Vcmax是由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶（Ribose-1,5-diphosphate Carboxylase / Oxidase，Rubisco）所催化的最大羧化反應速率，即植物葉片在單位時間單位面積所同化的最大CO2摩爾數[3]。植被葉片Vcmax作為光合作用的關鍵參數，受到光照、溫度、水分等環境因素的影響[4-5]。土壤氮素水平影響植物葉片大小和葉片氮素含量，進而影響植物的光合作用速率、光合量子效率和相關碳代謝酶活性[6]。由于葉肉細胞光合系統中的Rubisco 酶、光捕獲組分（葉綠素和相關蛋白）等均含有大量的氮元素，葉片含氮量對光合作用有顯著影響[7]。葉片含氮量通常與Vcmax表現為線性正相關，但該關系具有較大的時空變異，在不同的地理位置、不同季節、不同的植被類型的研究結果表現出一定差異性[8-9]。張緒成等通過對小麥研究后發現，施氮量的提高有助于葉面積的增大和Rubisco 的合成，從而使葉片Vcmax顯著提高[10]。Crous 等研究發現，施氮可以使火炬松葉片Vcmax與葉片含氮量關系式的斜率提升4.9%[11]。Walker 等研究表明，植被葉片Vcmax與葉片含氮量密切相關，增加葉片磷含量顯著提高Vcmax對葉片含氮量的敏感性，但是這種關系并不穩固，易受到環境和物種影響[12]。葉綠素也與葉片Vcmax有關。Croft 等研究發現，由于季節和物種的變化，葉綠素與植被葉片Vcmax的相關性要顯著高于葉片含氮量，且相較于葉片全氮含量，分配給Rubisco 的氮素含量與葉片Vcmax的相關程度要更為密切[13]。Qian 等通過研究多個類型植被后發現，葉片Vcmax與葉綠素有較為穩固的相關性，R2達到0.859，但是其研究并未涉及葉片含氮量[14]。

隨著葉片Vcmax在植物生理生態模型中的重要性越發凸顯，有關植被Vcmax的研究也日益增多，受限于傳統測量方法的低效率，大范圍的直接測量很難做到，如何快速、準確的測量植被Vcmax亟需解決。隨著遙感技術的發展，高光譜遙感已經成為植被實時監測和營養診斷的有效手段[15-16]。Dechant 等研究表明，即使在大量樹種和不同的光環境下，葉片反射率仍與植被Vcmax保持著較高的相關性，其中葉片含氮量光譜探測至關重要[17]。Gamon等對光化學植被指數（Photochemical Reflectance Index，PRI）進行了深入研究，研究表明，光合參數和PRI 會受到同等調節作用，并且PRI 還具有探測葉片Vcmax和氣孔導度的潛力[18]。Zhou 通過研究混交林和闊葉林后發現，Vcmax與歸一化差值植被指數（Normalized Difference Vegetation Index，NDVI）、增強型植被指數（Enhanced Vegetation Index，EVI）具有良好的相關關系，大部分相關系數能達到0.95，并且隨著季節變化，Vcmax與二者的關系也具有一定差異[19]。Dillen 等通過研究2 個樹種的葉片反射率和光合參數的季相變化，發現紅邊光譜指數與植被葉片Vcmax有較強的相關性，且氮素敏感光譜特征具有指示關鍵光合參數的潛力[20]。目前，關于Vcmax的研究多集中在林木，在作物上還鮮見報道，并且，植被葉片Vcmax易受植物本身的生物特性及環境影響。棉花是世界上重要經濟作物和纖維作物，有關棉花葉片Vcmax對氮素的響應特性及采用高光譜技術估測Vcmax的效果尚不明確。為此，本文以棉花為研究對象，測量了不同施氮水平下各個生育時期的葉片生理參數和光譜反射率，研究了葉片含氮量、葉綠素等生理參數與葉片Vcmax的關系，同時篩選出能準確反演棉花葉片Vcmax的高光譜植被指數，結果對深化葉片最大羧化速率響應機理、提高氮素光能利用效率和提高光合作用模型模擬精度具有重要科學意義，同時為遙感估測葉片光合能力參數提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2018—2019 年在河北省保定市河北農業大學三分廠試驗站（115°41′N，38°80′E）進行，試驗地化學性質如表1 所示。試驗品種選用棉花主栽品種國欣棉9號，分別于2018 年4 月28 日和2019 年5 月3 日播種，小區覆膜，設置4 個施氮水平，即0（N0）、120（N1）、240（N2）、480（N3）kg/hm2（常規施氮水平為120～240 kg/hm2）。其中50%作為基肥，50%在花鈴期追施。P、K 肥基施，分別為P2O5135 kg/hm2，K2O 75 kg/hm2。每個小區面積66 m2，隨機區組設計，重復3 次。其他管理措施同常規。

表1 試驗地化學性質 Table 1 Chemical property of experimental site

1.2 測定項目與內容

1.2.1 反射光譜測定

選擇晴朗無云的天氣，9：00—11：00，使用HR-1024i光譜儀（美國SVC 公司生產），利用儀器葉夾（自帶光源），測量頂部倒4 葉反射光譜。該光譜儀測量范圍350～2 500 nm，通道數1 024 個，光譜分辨率3 nm，視場角為25°，測量前均進行白板校正。

1.2.2 光合參數測量和Vcmax計算

葉片反射光譜測定后，使用Li-6400 便攜式光合系統（美國LI-COR 公司生產）測量棉花葉片的光合-CO2響應曲線（The Photosynthetic CO2Response Curve，A-Ci）。測量時間控制在9：00—11：00 和13：00—15：00 之間。A-Ci曲線參數設置：光強為1 500 μmol/(m2·s)，CO2濃度梯度為400、300、200、100、50、400、400、600、900、1 200、1 500 μmol/(m2·s)。測定完成后，采用R 語言，基于Farquhar 光合作用模型并校正到25℃，計算獲得葉片Vcmax[2]。

1.2.3 生理參數測定

葉綠素含量：將待測植物葉片去除中脈，剪成0.5 cm2小塊，稱取0.1 g，放入試管中，加入95%乙醇10 ml，塞上膠塞，震蕩后遮光浸提。期間不時搖動。待葉片變白（24～48 h）后比色。比色時以95%乙醇作為對照，在波長為665、649、470 nm 下比色，記錄各波長下的消光值，然后計算獲得葉綠素（Chlorophyllatb，Chl a+b，mg/g）含量。

比葉重：使用直徑1 cm 的打孔器打取15 個小圓片，105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重后測定葉片干質量。比葉重（Leaf Mass Area，LMA，g/cm2）即為葉片干質量和葉面積的比值。

葉片含氮量：將烘干后的葉片粉粹并研磨至粉末狀。葉片全氮測量分為消煮和檢測2部分，消煮采用H2SO4-H2O2法，使用連續流動分析儀（AA3，德國布郎盧比公司生產）測量葉片全氮含量（Total Nitrogen Content of Leaves，Nmass，mg/g）。

以上生理參數的測定在反射光譜測量和光合參數測量之后，且為同一葉片。

每個處理重復5 葉，各個生育時期測量1～3 次。每年除了各個生育時期測量之外，還進行3 次補充測量，每次測量對象為葉色由綠到黃的葉片，測量項目與生育時期測量一致。

1.3 高光譜指數選擇

光譜指數主要與葉片色素、細胞結構以及植物中的液態水和營養狀態等密切相關。為了使植被反射信息最大化，環境影響最小化，光譜指數的波段組合也參照一定的物理基礎，如選用對葉綠素高吸收的紅光波段和對綠色植被反射和透射的近紅外波段、對氮素敏感的紅、藍光波段和受細胞結構多次反射散射影響的近紅外平臺區等。本研究根據棉花的光譜特點，結合前人研究，選取對葉綠素、氮素含量和比葉重敏感的光譜指數進行分析。光譜指數主要分為比值植被指數（Ratio Vegetation Index，RVI）和歸一化差值植被指數（Normalized Difference Vegetation Index，NDVI）。具體計算公式見表2。

表2 光譜指數計算公式 Table 2 Spectral indexes computational formula

1.4 數據分析

使用一般線性回歸和多元逐步回歸建立生理參數與棉花葉片Vcmax、光譜指數與棉花葉片Vcmax的估算模型，建模數據包括所有生育期數據和補充測量數據，數據集劃分遵循隨機原則且覆蓋各個生育時期，其中約75%數據（n=220）用作訓練集，25%數據（n=80）作驗證集。精度評價指標選用均方根誤差（RMSE）和決定系數（R2），R2越接近1，RMSE 越小，說明模型參考價值的越高，Vcmax估算越準確。

2 結果與分析

2.1 不同施氮水平下棉花葉片Vcmax變化

由圖1 可知，棉花葉片Vcmax隨著季節變化呈現逐漸下降的趨勢，在苗期最大。2018 年，從出苗后44 d（苗期）至93 d（花鈴期），葉片Vcmax保持較高水平且各個處理間無顯著差異（P>0.05），說明施氮水平的不同沒有影響到葉片Vcmax。進入吐絮期，葉片Vcmax急劇下降，高施氮肥處理（N2、N3）的葉片Vcmax開始高于低施氮肥（N1）和不施氮肥處理（N0），且在最后一次測量（出苗后144 d）達到顯著差異（P<0.05）。2019 年，葉片Vcmax表現與2018 年略有差異，葉片Vcmax在苗期至蕾期并未受到施肥處理的影響，而出苗后103 d（花鈴期），高施氮肥下的葉片Vcmax就開始高于低施氮肥和不施氮肥處理，較2018 年提前20 d，并在出苗后122 d（吐絮期）達到顯著差異。

圖1 不同施氮水平下棉花葉片Vcmax 的季節性變化 Fig.1 Seasonal variatio le nv oefl sl ei anf c V oc tmtoaxn under different nitrogen

2.2 不同施氮水平下棉花葉片含氮量和葉綠素變化

由圖2 可知，葉片含氮量隨著季節變化呈現逐漸下降的趨勢，在苗期或蕾期達到最大值。在2018 年，出苗后93 d（花鈴期）之前，葉片含氮量并未隨著施氮量的增加而提高，在此之后，高施氮肥效果開始明顯，直至出苗后 128 d（吐絮期）后處理之間達到顯著差異（P<0.05）；與葉片含氮量有所差異，葉綠素在出苗后84 d（蕾期）就逐漸體現出施肥效果，且高施氮肥可以使葉綠素在生育期后期保持較高水平。

圖2 不同施氮水平下棉花葉片含氮量和葉綠素的季節性變化 Fig.2 Seasonal variations for leaf nitrogen and chlorophyll content under different nitrogen levels in cotton

2019 年，從出苗后73 d（蕾期）開始，高施氮肥下的葉片含氮量就顯著高于低施和不施氮肥的處理（P<0.05），隨著生育進程的推進，差異愈發明顯；葉綠素表現與2018年表現基本類似，都在蕾期（出苗后73 d）表現出處理差異，且高施氮肥有利于葉綠素在生育期后期保持較高水平。

2.3 棉花葉片Vcmax估算模型的構建

2.3.1 棉花葉片Vcmax與生理參數關系

棉花葉片Vcmax與生理參數的相關關系如圖3 所示。在2018 年，與葉片Vcmax相關程度最高的是葉片含氮量，模型擬合精度最高（R2=0.723），其次為葉綠素（R2=0.581），與比葉重關系最弱（R2=0.397）；2019 年，葉片Vcmax與生理參數的關系與2018 年表現一致。

基于2 a 數據建立了葉片含氮量和葉綠素與葉片Vcmax的一元線性回歸模型和多元逐步回歸模型，見式（1）～式（3）。比葉重與葉片Vcmax關系因相關關系較低，并未建模。

2.3.2 光譜指數與棉花葉片Vcmax關系

棉花葉片Vcmax與光譜指數的決定系數等高線圖如圖 4 所示。在NDVI 等高線圖中，紅邊波段與藍波段組合的光譜指數均具有較好的預測能力，紅波段與藍波段組合的光譜指數次之，其他波段組合預測能力較弱，其中決定系數最高的光譜指數為NDVI697,445（下標數字為2個波長，nm），R2達到0.752。RVI 等高線圖與NDVI等高線圖類似，決定系數最高的光譜指數為RVI445,694（下標數字為2 個波長，nm），R2達到0.760。

將前人研究所得的27 個植被指數（表2）與葉片Vcmax做相關性分析，結果如圖5 所示。有7 個與葉片Vcmax極顯著相關（P<0.01），其中相關程度最高的3個光譜指數分別是光化學植被指數（PRI）、改進葉綠素吸收植被指數（Modified Chlorophyll Absorption Ratio Index，MCARI）、修正型歸一化差值植被指數（Modified Normalized Difference Vegetation Index，mND705），相關系數絕對值均大于0.6。使用訓練集數據，以葉片Vcmax為因變量，將相關性表現最好的3 個光譜指數和本文篩選所得RVI445,694、NDVI697,445作為自變量，分別構建一元線性回歸模型和多元逐步回歸模型。回歸模型如表3 所示，RVI445,694、PRI 和mND7053 個光譜指數構建的多元逐步回歸模型精度最高（R2=0.809，RMSE=16.93 μmol/(m2·s)），且高于單變量回歸模型。

圖3 棉花葉片Vcmax 與含氮量、葉綠素和比葉重的相關關系 Fig.3 Correlation between nitrogen content, chlorophyll, leaf mass area and Vcmax in cotton leaves

圖4 棉花葉片Vcmax 與光譜指數的決定系數等R2 高線圖 Fig.4 Contour maps of coefficients of determination (R2) between Vcmax and spectral indices

圖5 棉花葉片Vcmax 與光譜指數的相關系數 Fig.5 Absolute value of correlation coefficients between Vcmax and spectral index in cotton leaves

表3 訓練集棉花葉片Vcmax 與光譜指數的反演模型 Table 3 Inversion models of Vcmax and spectral index in cotton leaves in training set

2.4 棉花葉片Vcmax估測模型精度檢驗

使用驗證集數據檢驗所構模型精度如表4 所示。Nmass-Vcmax、S-MSR、R-NDVI697,445、R-RVI445,694和R-MSR模型決定系數R2均高于0.7，其中R-MSR 精度最高（R2=0.787，RMSE=19.36 μmol/(m2·s)），其他模型精度較低，誤差較大。綜上所述，用生理參數和光譜指數構建棉花葉片Vcmax估算模型是可行的，其中以光譜指數RVI445,694、PRI、mND705所構建的多元逐步回歸模型要略優于以葉片含氮量和葉綠素構建的多元逐步回歸模型。

表4 驗證集棉花葉片Vcmax 真實值和估測值擬合結果 Table 4 Fitting result l se aovf eVs c imna x v t a rlui d e a atni o dn e s set itm ation value of cotton

3 討 論

綜合以上試驗數據來看，棉花葉片Vcmax與葉片生理參數和光譜數據存在著密切關系，這與前人的研究一致[13-14]。洪帥等研究發現，即使在不施氮的條件下，土壤中的養分也足以供應棉花苗期的生長發育[36]。本試驗同為施肥處理，但是由圖2 可知，在2018 年，直至出苗后第84 天（花鈴期），N0 處理下的棉花葉片含氮量并沒有低于其他施肥處理；2019 年，經過1 a 的施肥累計效應，N2、N3 處理下的葉片含氮量在蕾期就顯著高于N0、N1 處理。考慮到基礎地力較高的前提下，認為土壤中的養分足以供應棉花苗期至蕾期的正常生長發育，掩蓋了施肥效果。

閆霜等研究多個植被類型（不包含作物）的Vcmax后發現，隨著季節推移，Vcmax往往表現出先升后降的季節變化趨勢，其主要受到了LMA、葉片含氮量在Rubisco 的分配比例等影響[37]。而本研究表明，棉花葉片Vcmax隨著季節變化呈現逐漸降低的趨勢，在苗期達到最大值。此外，在2018 年苗期至花鈴期和2019 年苗期至蕾期，各個施肥處理下的葉片Vcmax并沒有顯著差異，表明在基礎地力較高的前提下，棉花葉片Vcmax在苗期至蕾期受施氮水平影響較小。并且，隨著生育期的進行，高施氮肥下的葉片Vcmax開始逐漸高于低施和不施氮肥處理，氮素逐漸成為影響葉片Vcmax高低的關鍵因素之一，高施氮肥（240～480 kg/hm2）可以使棉花葉片在生育期后期維持一定的光合能力。結合葉片含氮量、葉綠素等生理參數的季節變化，可以看出葉片含氮量的季節變化趨勢與葉片Vcmax的季節變化趨勢較為相近，從側面表明了Vcmax與葉片含氮量密切相關，與Miner 等的研究一致[38]。

葉片Vcmax作為決定光合能力的關鍵指標，其值的高低必然和葉片的生理狀態和環境密切相關。作為調控Rubsico 合成、協調光合組分比例的主要成分，葉片含氮量與葉片Vcmax成為最早的研究熱點。閆霜等通過研究不同功能型的植物葉片后發現，葉片含氮量與葉片Vcmax關系表現出一定差異性，其線性關系式的斜率平均值在16.29～50.25 μmol·g/(N·s)，大部分物種的葉片Vcmax隨葉片含氮量和光合氮利用效率變化趨勢相一致[37]。本研究結果表明，葉片含氮量與葉片Vcmax的相關程度最高，葉綠素與葉片Vcmax的相關程度次之，其他生理參數與葉片Vcmax的相關程度最低，兩年情況一致。這與Croft 等發現葉片Vcmax與葉綠素關系更密切有所出入[13]，這可能受到棉花物種的影響，也有可能是大田獨特環境的作用，畢竟葉綠素的多少與光合系統捕光組分的關系更加密切，而羧化系統受葉片含氮量的制約更為多一些[39]。此外，在以生理參數為自變量的葉片Vcmax估算模型構建中，以葉片含氮量和葉綠素為自變量的多元逐步回歸模型精度和準確度均要高于其他單變量線性模型，表明葉片含氮量和葉綠素相結合可以更好的擬合葉片Vcmax，為葉片Vcmax的擬合提供新思路。

雖然目前還沒有明確的光譜機理將葉片Vcmax和光譜反射率直接聯系起來，但可以利用某些與葉片Vcmax的密切相關的生理參數的光譜來反演Vcmax。王亞卿為了估算長白山地區的Vcmax，推導建立了Vcmax與光能利用率的穩定關系，并利用光能利用率與光譜的相關性，改進了傳統PRI，使其更適宜當地環境，可以更好的反演光能利用率和Vcmax[40]。本試驗通過對葉片Vcmax和光譜指數進行回歸分析發現，由紅邊波段與藍波段組合的光譜指數可以較好的預測棉花葉片Vcmax，其中表現最好的光譜指數為NDVI697,445和RVI445,694。隨后在以光譜指數為自變量的葉片Vcmax估算模型的構建中，由NDVI697,445和RVI445,694所構建的葉片Vcmax估算模型精度要遠高于其他估算模型，R2均超過0.75。除此之外，由RVI445,694、PRI、mND705所構建的多元逐步回歸模型精度最高（R2=0.809，RMSE=16.93 μmol/(m2·s)）。最后，在本試驗所構建的棉花葉片Vcmax估算模型中，由RVI445,694、PRI、mND705所構建的多元逐步回歸模型精度最高，葉片含氮量和葉綠素所構建的的多元逐步回歸模型次之（R2=0.801，RMSE=17.01 μmol/(m2·s)），其他估算模型精度要稍弱；驗證結果也是如此。綜上所述，使用光譜數據構建棉花葉片Vcmax估算模型是可行的，且精度和準確性可以優于生理參數，擬合效果更好，為棉花葉片Vcmax光譜反演提供理論支持。因測定葉片A-Ci 時間較長，野外測量不可避免地受到光照、溫度等環境條件的影響，是否會影響到模擬結果有待于進一步研究。另外，不同學者計算Vcmax采用的模型不盡相同，也可能對結果產生影響。

4 結 論

本研究以葉片生理參數和光譜數據為基礎，揭示了氮素水平對棉花葉片最大羧化速率（Maximum Carboxylation Rate，Vcmax）的影響，構建了生理參數與棉花葉片Vcmax的估算模型，并根據本試驗數據提出了與棉花葉片Vcmax擬合度高的光譜指數，同時分析了27 種前人光譜指數與棉花葉片Vcmax的相關關系，在此基礎上選擇相關關系較好的光譜指數構建線性回歸和多元逐步回歸模型，得出以下結論：

1）在基礎地力較高的前提下，不施氮肥土壤中的氮素足以保證棉花葉片Vcmax在苗期至蕾期保持較高水平，隨著生育期進行，氮素逐漸成為影響葉片Vcmax高低的關鍵因素之一；高施氮肥（240～480 kg/hm2）有助于棉花葉片Vcmax保持較高水平，在吐絮期尤為顯著。

2）以葉片生理參數為自變量所構建的棉花葉片Vcmax估算模型中，由葉片含氮量和葉綠素所構建的的多元逐步回歸模型精度最高（R2=0.801，RMSE=17.01 μmol/(m2·s)），高于由葉片含氮量、葉綠素所構建的單變量估算模型。

3）提取出與棉花葉片Vcmax擬合度高的光譜指數NDVI697,445和RVI445,694，篩選到與葉片Vcmax相關程度最高的3 種前人光譜指數PRI、MCARI 和mND705，分別構建一般線性回歸和多元逐步回歸模型，其中精度和準確度最高的是由RVI445,694、PRI 、mND705所構建的多元逐步回歸模型（R2=0.809，RMSE=16.93 μmol/(m2·s)），高于其他單變量線性回歸模型。