碳酸鈣和殼聚糖聯用對高pH 值石灰性土壤砷污染的鈍化

焦常鋒，常會慶，王啟震，吳 杰，朱曉輝，王 浩

（河南科技大學農學院，洛陽市共生微生物與綠色發展重點實驗室，洛陽市植物營養與環境生態重點實驗室，洛陽 471023）

0 引 言

砷（As）是中國生態環境部五大重點監控的金屬污染元素之一。由于含砷礦物的開采，含砷農藥如甲基硫砷、稻寧等的大量施用以及污泥農用等人為活動向土壤中輸入大量的砷，并通過吸附沉淀、離子交換、絡合、氧化還原等反應使土壤中的砷含量不斷上升。2014 年，生態環境部發布的《全國土壤污染狀況調查公報》顯示，中國土壤砷的點位超標率高達2.7%，在8 大重金屬中僅次于鎘（7%）和鎳（4.8%）。污染土壤中砷容易被農作物吸收并在可食用部分累積，不僅導致農作物產量下降，而且通過食物鏈危害人體健康[1-2]。

土壤酶活性對環境變化敏感，易受外界環境和土壤性質的影響，并與重金屬污染的種類和污染程度存在一定的相關性，土壤酶特征指標變化可以快速反映出土壤重金屬污染的毒害效應。因此，重金屬對作物產生明顯毒害之前，可以借助土壤酶靈敏地反映出土壤生化反應的方向和強度[3]。

砷（As）在土壤環境中多以五價砷酸鹽[Arsenate，As（Ⅴ）]和三價亞砷酸鹽[Arsenite，As（Ⅲ）]等無機陰離子的形式存在[4-5]，并且As（Ⅴ）是土壤中主要的存在形式[6]。砷的毒性效應不僅與其總量有關，更大程度上取決于它的化學形態及相應含量[7]。因此，為了消除土壤砷污染的毒害影響，經常使用鈍化劑的方法來降低其生物有效性。鈍化劑修復方法具有操作容易、成本低、對土壤環境擾動小等優點[8]，碳酸鈣等堿性材料鈍化劑通常通過提高土壤pH 值來修復酸性土壤中Cu、Pb、Cd 等重金屬的污染[9-10]。殼聚糖作為一種天然高分子有機碳化合物，其豐富的官能團對多種正價態重金屬離子起到絡合而減少土壤對重金屬吸附，然后結合植物修復方法達到去除重金屬的目的[11-12]。

土壤pH 值和Ca、Fe、Al 等元素的含量都會對As的效態性產生影響。土壤pH 值升高時，土壤膠體上的正電荷減少，通常會導致帶負電荷的砷酸根更多地游離在土壤溶液中，因此會導致土壤中As 有效性提高。但另一方面石灰性土壤中含有大量Ca，極容易與As 形成Ca-結合態As，從而降低其有效性。并且大量研究已表明與pH 值和碳酸鈣含量較低的土壤相比，由于高pH 值石灰性土壤中碳酸鈣等碳酸鹽的含量高，容易使土壤Ca-結合態As 有增加趨勢[13-14]，但高pH 值石灰性土壤上再添加碳酸鈣能否對砷污染起到鈍化作用缺乏研究，尤其碳酸鈣和殼聚糖聯用對砷的鈍化效果如何還少有報道。因此，本研究選擇高pH 值石灰性土壤為研究對象，以土壤酶活性的變化表征砷污染影響，通過探究碳酸鈣和殼聚糖聯用對砷污染的鈍化效應，旨在為該類土壤的安全生產提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

本試驗在河南科技大學農場開展，該農場位于河南省西部的洛陽市（34°41′N；112°27′E），試驗點地處溫帶大陸性季風氣候，年均氣溫12.2～24.6 ℃，無霜期210 d 以上，年降水量、日照和年均濕度分別為528～800 mm、2 200～2 300 h 和60%～70%。

1.2 供試材料

供試土壤的理化性質見表1。供試作物為夏玉米，品種為鄭單958。供試鈍化劑采用碳酸鈣（Ca）和殼聚糖（C），工業生產的碳酸鈣等堿性類鈍化劑成本低廉，常被作為酸性土壤的改良劑使用，殼聚糖作為一種天然的高分子有機物，可由沿海地區低廉和豐富的蝦殼、蟹殼和牡蠣殼等原料制備。

1.3 試驗設計

田間試驗采用隨機區組設計，共設置4 個處理：1）對照（CK）：土壤中既不添加外源砷，也不添加任何鈍化劑；2）砷污染（As）：1 kg 土壤中添加外源砷80 mg，不添加鈍化劑；3）砷污染+碳酸鈣（As+Ca）：1 kg土壤中添加外源砷80 mg 與鈍化劑碳酸鈣2 g；4）砷污染+碳酸鈣+殼聚糖（As+Ca+C）：1 kg 土壤中添加外源砷80 mg、碳酸鈣2 g 和殼聚糖1.2 g。每個處理重復3 次，每個處理的小區面積為2 m2。

砷污染土壤的培養：利用砷酸鈉為外源砷，砷污染水平設定為土壤環境質量標準（GB 15618—2018）的篩選值和管控值之間（1 kg 土壤含有砷80mg）。播種前90 d進行砷污染老化處理，首先把小區0～20 cm 土壤層全部移入到不透水的塑料膜上，通過人工翻堆使相應濃度的砷溶液與表層土壤混合均勻，然后再回填到相應小區中。

鈍化劑和肥料的施用：種植玉米前（6 月份）在相應小區中添加碳酸鈣和殼聚糖[10-11]，同時每個處理添加尿素（1 285 kg/hm2）、過磷酸鈣（570 kg/hm2）和氯化鉀（240 kg/hm2）作為基肥。

1.4 樣品采集與分析

10 月份玉米成熟后，采集土壤樣品，風干后分別過0.85 和0.12 mm 的土篩備用。土壤基本理化性質測定參照《土壤農業化學分析方法》[15]。土壤中不同形態砷的提取參照石灰性土壤中砷形態分級方法[16]：分為水溶態、交換態、鈣結合態（鈣-砷）、鐵結合態（鐵-砷）、鋁結合態（鋁-砷）和殘渣態等形態（提取劑分別采用H2O、CH3COOH、H2SO4、NaOH、NF4F 和H4ClO4、HF 和HNO3）。提取后的砷采用原子熒光儀進行測定；土壤活性鈣為H2O和CH3COOH 提取鈣總含量，利用電感耦合等離子光譜儀（Inductive Coupled Plasma Emission Spsctrometer）進行測定。土壤脲酶、纖維素酶和過氧化氫酶分別采用靛酚藍比色法測定、3,5-二硝基水楊酸比色法和高錳酸鉀滴定法測定。玉米樣品砷的測定：玉米收獲后，將其根、莖、葉和籽粒分別用蒸餾水洗凈烘干，稱取一定量的上述樣品用雙氧水-濃硝酸溶液消解，樣品消解完全后，酸至近干，加少量稀硝酸溶液溶解后轉移定容，利用原子熒光儀進行測定。對照分析已知成分的標準參考土壤和谷物材料（土壤-GBW07440；谷物-GBW10046），要求重金屬的回收率達80%以上作為檢驗上述土壤和作物重金屬分析方法的準確性。

1.5 數據分析

采用SPSS 13.0 軟件進行相關數據統計，用最小顯著性差異法（Least Significant Difference，LSD）進行差異顯著性檢驗（P<0.05）。同時引入以下參數，表征外源砷在土壤中各形態的分布情況及其生物有效性。

式中T1～T6分別表示水溶態、交換態、鈣-結合態、鐵結合態、鋁結合態、殘渣態砷質量分數（mg/kg）

表1 土壤基本理化性質 Table 1 Basic physic-chemical properties of soil

2 結果與分析

2.1 土壤-作物主要參數變化

土壤的主要理化參數和根際中鈣含量變化都會影響砷的有效態及作物對其吸收[18]。外源As 和碳酸鈣的添加可提高土壤pH 值，但殼聚糖的添加降低了土壤pH 值（表 2）。與CK 處理相比，As、As+Ca 和As+Ca+C 處理分別顯著提高了土壤pH 值0.18、0.32 和0.16（P<0.05）。砷污染土壤中碳酸鈣-殼聚糖聯用與單獨添加碳酸鈣鈍化處理相比，土壤pH 值顯著降低了0.16（P<0.05），但與As 處理相比，土壤pH 值降低程度不顯著。土壤中有機質變化受外源重金屬的影響，土壤As 污染會減弱石灰性土壤中有機物質的礦化速率，增加土壤有機質的積累[19-20]，與CK 處理相比，各As 污染處理的有機質含量有所提高，其中As 處理的有機質含量顯著提高了0.7%（P<0.05）。添加鈍化劑碳酸鈣有利于增加土壤中碳酸鹽的含量，As+Ca 處理與CK 相比，土壤碳酸鈣含量顯著增加，但As 污染各處理的碳酸鈣含量差異不顯著。和CK處理相比，砷污染會顯著降低土壤活性鈣和玉米根系中鈣的含量，但碳酸鈣鈍化后會顯著增加土壤活性鈣和玉米根系鈣的含量，尤其As+Ca+C 處理與As+Ca 相比，土壤活性鈣和玉米根系鈣分別顯著增加了0.52 和0.13 g/kg（P<0.05）。

表2 土壤-作物相關參數比較 Table 2 Comparison parameters of soil-crop

2.2 鈍化劑添加對土壤砷形態的影響

砷在土壤中的形態變化反映了砷的活動能力以及被作物吸收的程度。表3 為不同處理條件下土壤中各形態As 的含量。CK 處理中，水溶態和交換態As 之和小于0.2%，殘渣態As 所占比例在99%以上，可見高pH 值石灰性土壤上As 的主導形態為殘渣態。與CK 相比，加入外源As 后，土壤中6 種形態的As 含量均有所增加，且各處理中仍以殘渣態As 的含量最高。研究中各處理的水溶態As 含量差異顯著（P<0.05），As 污染的各處理中，鈍化劑的施用有利于水溶態As 含量的降低，尤其碳酸鈣與殼聚糖聯用顯著降低土壤中水溶態砷的含量。與As 處理相比，As+Ca 和As+Ca+C 處理的水溶態砷分別顯著降低17.15%和27.03%（P<0.05）；As+Ca+C 處理的鈣-砷、鐵-砷和鋁-砷分別顯著升高了13.97%、14.24%、13.85%。可見高pH 值石灰性土壤上加入鈍化劑后，依然可以促使土壤中As 向難于作物吸收的形態轉化。通過公式（2）計算可知，碳酸鈣、碳酸鈣與殼聚糖聯用對砷污染的鈍化率分別達9.78%和18.73%。因此，碳酸鈣和殼聚糖聯合使用可以對高pH 值石灰性土壤上As 污染起到較好鈍化效果。

表3 不同處理各形態砷的含量 Table 3 The content of different fraction arsenic in different treatments (mg·kg?1)

2.3 鈍化劑添加對玉米砷積累的影響

添加鈍化劑會對玉米根、莖、葉和籽粒的As 含量及其富集系數產生影響（表4）。砷污染會導致玉米各部位As 含量的增加，各部位As 含量的大小表現為：根>葉>莖>籽粒，與CK 相比，外源As 的添加會顯著增加籽粒中的As 含量，但是玉米籽粒As 含量沒有超出食品安全國家標準《GB2762—2017》的規定值，且與As 處理相比，As+Ca 處理會顯著降低玉米籽粒和莖稈中的As 含量，而As+Ca+C 處理則顯著降低了玉米籽粒、根、莖、和葉等部位的As 含量（50%、13.98%、16.51%、14.94%）。As+Ca+C 和As+Ca 處理相比，玉米上述各部位的As 含量顯著降低了20%、11.09%、8.08%、11.38%。另外，外源As 污染改變了玉米各部位對As 的富集系數，和As 處理相比，碳酸鈣的添加顯著降低了籽粒和莖對As 的富集系數。碳酸鈣和殼聚糖聯用較單獨的碳酸鈣添加處理可顯著降低玉米各部位對As 的富集系數。可見，As 污染石灰性土壤上種植玉米配合鈍化劑的施用更有利于其安全生產。

表4 玉米各部位的砷含量及富集系數 Table 4 Content and enrichment coefficient of arsenic in various parts of maize

2.4 土壤酶活性及與各形態砷的相關關系

土壤脲酶活性在一定程度上可反映土壤有機態氮向有效態氮的轉化能力和土壤無機氮的供應能力；土壤纖維素酶是土壤碳循環中一種重要的酶，可以用來評價土壤中有機質含量[21]；土壤過氧化氫酶可以用來指示土壤重金屬的污染程度[22]。因此，本研究選擇上述酶活性變化來表征外源砷污染對土壤的毒害影響（表5）。與CK處理相比，As 污染條件下土壤脲酶、纖維素酶和過氧化氫酶活性受到抑制，且分別顯著降低了37.9%、50.0%、10.2%。添加鈍化劑后，As+Ca 和As+Ca+C 處理的脲酶、纖維素酶、過氧化氫酶活性分別恢復至CK 處理的81.84%和94.62%，86.20%和87.60%，93.37%和97.59%。與砷污染處理相比，碳酸鈣和殼聚糖聯用使土壤脲酶、纖維素酶和過氧化氫酶活性分別顯著提高了52.35%、74.92%、8.72%（P<0.05）。可見，加入鈍化劑可有效緩解As 污染對上述土壤酶的毒害作用，而且碳酸鈣和殼聚糖聯用的效果要好于單獨添加碳酸鈣的效果。土壤各形態砷與3種酶活性都呈負相關關系（表6），其中水溶態As 與3種酶呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負相關關系，交換態 As 與尿酶和纖維素酶呈顯著負相關關系（P<0.05），其余各形態As 與土壤3 種酶活性之間的相關性不顯著（P﹥0.05），可見土壤水溶態和交換態As是影響3 種土壤酶的主要As 形態。

表5 不同處理土壤脲酶、纖維素酶和過氧化氫酶活性 Table 5 Urease, cellulase and catalase activities in different treatments

表6 土壤酶與土壤各形態砷的相關關系 Table 6 Correlation between soil enzymes and soil arsenic

3 討 論

3.1 土壤pH 值影響砷的吸附，土壤組成決定砷的形態

土壤對As 的吸附受pH 值影響顯著，在pH 值2～11之間，As（V）主要以H2AsO4-和HAsO42-的形式存在，pH 值≤5 時，土壤膠體上帶正電荷較多，使土壤吸附As的能力增強[23]；當pH 值>5 時，隨著pH 值的增大，土壤膠體上所帶負電荷增多，會使土壤吸附As 的能力減弱。所以隨著pH 值增大，通常土壤砷的遷移能力增強[24]。當外源砷進入土壤后，其形態變化與土壤組成密切相關，在酸性土壤中Fe-As 和Al-As 含量要遠高于Ca-As[14]，但在石灰性土壤中由于CaCO3、鹽基離子飽和度比酸性和中性土壤高，而Fe 和Al 含量要遠低于酸性和中性土壤，故此石灰性土壤中的Ca-As 是主導的砷形態[25]，即便是外源砷污染在石灰性土壤中只老化了30 d，Ca-As 的含量依然較高。原因在于外源As 在土壤中最佳緩沖階段是9～17d[26]，無論三價或五價砷進入土壤后，都會迅速與土壤中的Ca、Fe、Al 等離子或氧化物發生沉淀反應，故此其水溶態的含量通常較低，尤其在石灰性土壤中有效態砷含量通常小于1%[16]，本研究也得到相似的研究結果。因此作者認為酸、堿性不同土壤對砷的有效性影響，并不是簡單依據pH 值的大小去做出結論，而且要綜合考慮和砷酸根離子所結合金屬離子的絕對含量及其相對豐度。

3.2 鈍化劑添加對堿性土壤As 形態影響

本研究發現，外源As 添加高pH 值石灰性土壤后，其形態仍然以殘渣態為主，且其含量占總量的60%以上，其余各形態含量的大小順序依次為鈣-砷、鐵-砷、鋁-砷、交換態和水溶態。可見高pH 值石灰性土壤上鹽基離子（如鈣）與As 的復合沉淀依然是主導的土壤過程。已有研究表明石灰類鈍化劑的添加能降低土壤中As 的浸出，主要原因是Ca 能與土壤交換態As 形成難溶的As-Ca 絡合物砷酸氫鈣（CaHAsO4）和砷酸鈣［Ca3(AsO4)2］沉淀[27-28]，杜彩艷等[29]也發現土壤中利用鈍化劑后提高土壤pH 值的同時，降低了土壤中有效態As 和玉米籽粒As含量。本研究同樣發現As 污染石灰性土壤加入碳酸鈣后提高了土壤的pH 值，但土壤中有效態As 和玉米籽粒As含量的降低。原因在于在高pH 值石灰性土壤上添加碳酸鈣后，可以增加土壤中的活性鈣和玉米根系中鈣的含量（表2），而增加的土壤活性鈣與有效性砷形成Ca-As 沉淀，使土壤中有效態砷含量降低（表3）。玉米根系中增加的鈣也會使As 離子沉積在根系，從而有利于玉米籽粒As 含量的降低。

殼聚糖等電點位是6.3，在pH 值>6.3 時，殼聚糖上豐富的氨基、羥基和酰氨基帶負電荷，可以和土壤膠體上的鈣等堿土離子結合[30]，從而提高土壤中吸附態的堿土離子的解析率，達到增加土壤中有效態鈣離子作用（表 2），另外碳酸鈣的施用同樣會增加土壤Ca2+，上述原因增加的有效態鈣離子通過和 As 形成沉淀Ca-As 最終起到聯合鈍化作用（表3）。該機制通過測試分析不同處理間土壤中活性鈣離子的含量加以證明，殼聚糖類似效應也已在文獻中得到證實[31]。故此，碳酸鈣和殼聚糖聯合施用可以起到對外源砷更有效的鈍化作用。

3.3 鈍化劑添加改善土壤酶活性

本研究中外源As 的污染程度已經超過了土壤篩選值，但作物籽粒中As 含量并沒有超出國家規定的食品衛生標準《GB2762—2017》。因此，單純分析土壤-作物的As 含量很難全面衡量砷污染對土壤質量和作物的影響。土壤酶在土壤養分循環、物質和能量轉化等過程中有重要作用，同時土壤酶活性是衡量土壤生物學活性和土壤生產力的重要指標[32]。As 污染降低土壤酶活性主要原因是砷進入土壤后與酶的活性中心或與酶分子的巰基、胺基和羧基的結合形成絡合物，致酶分子結構發生改變，從而影響其活性[33]。另外，As 可能抑制土壤中微生物的生長繁殖，進而使土壤酶的分泌和合成減少，導致土壤酶活性降低[34]。雖然土壤中交換態和水溶態As 含量較少，但它們對生物的有效性比其他形態的As 更大，鈍化劑的施加降低了有效態砷的含量，有利于微生物的生長和代謝，提高脲酶活性，緩解了As 對土壤酶活性的毒害作用[35]。周丹等[36]對As 污染農田土壤的研究表明：土壤脲酶活性、過氧化氫酶活性與總砷、可利用態砷都呈顯著的負相關。本研究砷的污染使得石灰性土壤的脲酶、纖維素酶及過氧化氫酶的活性呈現降低趨勢，說明該污染程度已經對土壤生物活性產生不利影響，添加碳酸鈣或碳酸鈣和殼聚糖后，上述酶的活性均有所提升，說明鈍化劑施用有利于緩解高pH 值石灰性土壤上As的毒害。

4 結 論

1）該研究的As 污染濃度會對高pH 值石灰性土壤的脲酶、纖維素酶和過氧化氫酶活性產生不利影響，碳酸鈣和殼聚糖聯用可以有效緩解As 污染對上述參數的影響，使土壤脲酶、纖維素酶和過氧化氫酶活性分別顯著提高了52.35%、74.92%、8.72%（P<0.05），且施用效果優于單施碳酸鈣處理。

2）高pH 值石灰性土壤上碳酸鈣和殼聚糖聯用可以更好起到對As 污染的鈍化作用，其對砷污染的鈍化率達18.37%，該鈍化效果表現為顯著降低土壤中水溶態As 和玉米各部位As 的含量分別顯著降低27.03%和50%（P<0.05），同時Ca-As、Fe-As 和Al-As 含量顯著增加。因此，玉米種植配合上述鈍化劑施用，可實現砷污染高pH 值石灰性土壤的安全生產。

碳酸鈣和殼聚糖都具有易得廉價等優點，由于碳酸鈣相比其他石灰類鈍化劑其施用不會導致土壤pH 值有較大幅度的變化，尤其適合在石灰性土壤上大面積應用；殼聚糖與其他的化學螯合劑相比，它在環境中的危害較小，容易降解，能夠被植物吸收利用，因此碳酸鈣和殼聚糖聯合大面積的應用具有較大潛力。