光照強度對菌藻共生生物膜細菌群落結構的影響

朱 林，車 軒※，劉興國，劉一萌，劉 晃，陳曉龍

（1. 中國水產科學研究院漁業機械儀器研究所 上海 200092；2. 中國水產科學研究院東海水產研究所 上海 200090）

0 引 言

隨著中國現代經濟的高速發展和人口劇增，水體富營養化、重金屬及抗生素水體污染已成為中國最為關注的環境問題之一[1]。傳統的物理處理法效率低，處理不徹底且能耗較大；化學處理法使用的試劑一般具有毒性，會對環境造成二次污染[2]。生物處理法符合自然生態原則和環境友好型宗旨，成為近年來的發展趨勢。常用的生物處理方式主要有菌藻共生系統、單獨藻類系統和單獨細菌系統，單獨藻類系統由于過度消耗CO2，pH 值一般達到9 以上，pH 值過高會抑制一般微生物的生長，且不利于水的再利用；單獨細菌系統有污染物耐受能力低的缺陷。而菌藻共生系統能克服以上2 個缺點[3]。

對于一般的生物處理來說，曝氣所需的成本占到整個處理的50%左右[4]，細菌和微藻的協調作用不僅提高氮磷的去除效果，還能省去曝氣操作，因此，利用菌藻共生系統來處理廢水能大幅降低運行成本。此外，有機物降解所產生的二氧化碳被微藻吸收后，減少了溫室氣體排放，這也是傳統好氧處理法不具備的優勢之一[5]。菌藻共生系統研究始于20 世紀50 年代末，Oswald 等報道了氧化塘中藻菌共生和藻類光合放氧等現象，提出了利用高效藻類塘處理污水的新工藝[6]。先后發展出懸浮菌藻系統、固定化菌藻系統及菌藻生物膜系統[7]，其中菌藻生物膜系統利用微藻本身易于附著的特性，附著在載體表面，生物膜易于形成，優勢菌種和藻類不易流失，處理效果優于懸浮菌藻系統，且成本較低，比其他2 種菌藻共生系統更具優勢[8-10]。

微藻與細菌之間的相互作用較為復雜，作用形式多種多樣，既包括相互利用代謝產物的互利共生關系，也包括對營養物質的相互競爭和抑制關系[11-12]。如果環境中的營養物質不能夠滿足細菌和微藻共同生長需要時，細菌和微藻就會產生對營養物質的相互競爭[13-15]。同時，在黑暗環境中微藻的呼吸作用也會吸收環境中的氧氣，從而與細菌產生對氧氣的競爭。“菌藻共生”是指將細菌對污水中污染物的降解能力與藻類吸收去除污水中N、P 和有機物的功能結合在一起[16]，如何利用菌藻之間的互利共生關系更好的構建菌藻系統是提高其水處理效果的關鍵。關于菌藻共生體與光的關系，研究人員做了不少工作，包括光穿透和混合不足導致細菌呼吸和微藻光合產氧之間失衡、通過膜光生物反應器收獲藻體、利用閉合反應器來解決菌藻共生系統中捕食者的問題等[17-19]。但尚未見光照強度與菌藻共生生物膜細菌群落關系的報導，因此筆者選擇了不同光照強度水平作為研究切入點。本試驗構建了3 組生物膜反應器，設置3 種不同的光照強度，對3 組菌藻共生生物膜的水質數據及細菌群落進行監測和分析，以期為菌藻關系研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 生物膜光反應器

于農業部漁業裝備與工程重點開放實驗室內建設3組生物膜光反應器如圖1 所示，系統主要由蓄水池，生物膜反應床及冷暖水機3 大部分組成，面積0.5 m2（長1.016 m，寬0.46 m），水層厚度2 cm，由6 mm 厚的PVC板制成。生物膜反應器上方30 cm 設置5 個日光燈（光照強度0～8 000 lx，可調），下方放置生物膜掛膜載體。反應器前設置容積100 L 的進水池，由水泵驅動進水，流量5 L/h，水力停留時間2 h。通過冷暖水機將整個試驗過程水溫控制在25 ℃。CK 組、T1 組及T2 組光照強度依次設置為0，4 750 lx，7 580 lx，每組3 個重復。

圖1 試驗系統3D 示意圖 Fig.1 Three-dimensional schematic diagram of test system

1.2 人工配水反應器接種

試驗采用醋酸和人工廢水配置碳氮比為1∶1 模擬養殖廢水，分別在3 組試驗系統中進行反應器馴化。廢水營養鹽成分為 NH4Cl 38.5 g/m3、NaHCO33 g/m3、MgSO4·7H2O 0.5 g/m3、MnSO4·H2O 0.15 g/m3、K2HPO47.4 g/m3、FeCl3· 6H2O 0.2 g/m3。系統啟動后，進行微藻和細菌接種。微藻接種液為淡水池塘養殖水，藍藻為優勢種，接種量100 mL，細菌接種液為淡水養殖池塘底泥，變形菌門為優勢種，接種量5 g。

1.3 水質測定方法

試驗過程中，使用水質多參數分析儀（YSI6920）測定水體等理化特征，主要包括水溫、溶氧（Dissolved Oxygen，DO）、pH 值、氧化還原電位等。使用多參數水質分析儀（HACH DR-2800）及萘乙二胺分光光度法、納氏試劑分光光度法及紫外分光光度法分別測定亞硝態氮（NO2--N）、氨氮（NH4+-N）、硝態氮（NO3--N）。

1.4 樣品預處理及總DNA 提取

待生物膜成熟后，用滅菌手術刀將載體上的生物膜刮下，注入PBS 緩沖液，高速渦旋振蕩5 min，反復操作10 次，收集水樣，將水樣在15 000 r/min 下離心15 min，取沉淀物用于總DNA 提取，采用E. Z. N. A. ? Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，GA，U.S.）按照試劑盒上的說明書進行提取，提取的DNA 用TE 緩沖液（10 mmol /L Tris-HCl，1 mmol /L EDTA，pH 值8.0）溶解，并用NanoDrop? 2000（Thermo Scientific，USA）測定DNA含量及質量，最后保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.5 樣品測序

采 用 細 菌 通 用 引 物 338F（ 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ ） 和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對樣品16S RNA的V3～V4 區域進行擴增[20]，PCR 擴增體系（共20 μL）：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上下游引物各0.8 μL（5 μmol/L），FastPfu Polymerase 0.4 μL，DNA 模板10 ng，用滅菌超純水補足至20 μL，PCR 反應在ABI GeneAmp ? 9700 擴增儀上進行。PCR 反應條件：95 ℃下預變性3 min；55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸45 s，共進行28 個循環；最后在72 ℃下再延伸10 min。

擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳測定，采用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.）切膠回收PCR 產物，使用QuantiflourTM-ST藍色熒光定量系統（Pro-mega，U.S.）定量。使用TruSeqTMDNA Sample PrepKit 試劑進行MiSeq 文庫構建，最后由上海美吉生物醫藥有限公司進行測序。

1.6 數據處理與統計分析

基于SPSS 18.0 軟件，利用One-way ANOVA，對不同處理的水質參數和細菌門屬分類水平的相對豐度進行單因素方差分析；采用QIIME Pipeline Version 1.8.0 進行序列拆分和質量控制[21-23]，使用UCLUST 序列比對軟件，控制閾值為97%的序列相似度作為OTU劃分標準，合并劃分OTU，并剔除豐度值低于0.001%的OUT，所有OTUs 通過與SILVA（SSU123）16S rRNA 數據庫進行比對后確定其微生物歸類[22]。利用Mothur 軟件構建稀釋性曲線（rarefaction curve）[23]，并計算Shannon 指數及Chao1 指數[24]。

2 結果與討論

2.1 氨氮濃度、亞硝氮及硝氮濃度變化趨勢

CK 組、T1 組及T2 組光反應器系統水質變化趨勢分析如圖2 所示，圖2 表示的是CK 組、T1 組及T2 組氨氮濃度變化趨勢，CK 組、T1 組及T2 組試驗啟動時氨氮濃度都是 10 mg/L，在第 7 天 T2 組氨氮濃度降到(0.8±0.14) mg/L，此時CK 組及T1 組氨氮濃度分別為(3.8±0.46)、(5.98±0.89) mg/L。圖2a 所示的是CK 組、T1 組及T2 組系統亞硝氮濃度變化趨勢，第7 天時CK組亞硝氮濃度升到(7.62±1.25)mg/L，此時CK 組及T1組亞硝氮濃度分別為(5.76±0.86) L、(2.34±0.45) mg/L；CK 組在第12 天時亞硝氮濃度率先降到0 mg/L，CK 組在第14 天亞硝氮濃度率先降到0，CK 組在第16 天亞硝氮濃度率先降到0。圖2c 所示的是CK 組、T1 組及T2組系統硝氮濃度變化趨勢，均呈上升趨勢，其中，CK組、T1 組及T2 組系統硝氮濃度最高值達到(59.3±8.36)、(35.8±4.76)及(24.9±3.62) mg/L。試驗啟動時CK 組、T1組及T2 組系統硝氮濃度均為(0.32±0.01) mg/L，第2 天CK 組菌藻共生生物膜系統硝氮濃度升到(11.28±1.35) mg/L，此時T1 組及T2 組硝氮濃度分別為(2.93±0.36)、(2.96±0.41) mg/L。

圖2 菌藻共生生物膜細菌群落氨氮、亞硝氮及硝氮濃度變化曲線 Fig.2 Change curve of ammonia nitrogen, nitrite, nitrogenous concentration in bacterial community of symbiotic biofilm of bacteria and algae

2.2 16S rDNA 測序分析

2.2.1 Alpha-多樣性分析

不同光照處理的Alpha 多樣性指數變化關系如表1 所示。各處理的覆蓋率均大于98%，說明本次試驗獲得的細菌序列覆蓋度較好，其測序深度可以滿足細菌群落結構組成及多樣性分析。總體可以看出，T1 處理和T2 處理的Alpha 多樣性指數，包括獲得的OTUs 數量（498.5±7.16、517.2±10.36）、Chao1 指數（648.7±35.64、672.8±30.69）和Shannon 指數（4.68±0.01、4.85±0.03）均顯著高于CK處理（406.6±8.18，521.5±18.62，3.53±0.02）。該結果表明，無光處理降低了生物膜細菌多樣性指數，CK 組菌藻生物膜的細菌群落在總體數量上處于弱勢，顯著低于處理T1 和T2，菌藻生物膜的細菌群落數量隨著光照強度的升高而增加。Mandal 等發現前環藻（Amphidinium carterae）分泌的胞外聚合物可以促進枯草芽孢桿菌（Bacillus pumilus）的生長[25]。在森林生態系統中，因為微生境環境因子的改變，林隙微生物的代謝途徑得到了提升[26]，微生物種類增多，尤其是r 策略種[27]。本次試驗中，隨著光照強度增強，菌藻生物膜細菌群落在總體數量上處于升高趨勢，可能是微藻光合作用過程中產生的氧氣或有機物誘導細菌需氧生長，形成宜于菌群繁殖所需的適宜環境，進而促進了生物膜菌群的活動。本次的試驗發現，間接佐證了關于光照強度的提高導致微生物多樣性升高的研究結果[28]。 注：OUT：可操作分類單元；同行數據后不同字母表示差異顯著（P<0.05）。 Note： OTU： operational taxonomic units; Different letters after peer data indicate significant difference.

表1 3 個處理細菌群落Alpha-多樣性指數分析 Table 1 Analysis of Alpha-diversity index of bacterial community in three treatments

2.2.2 3 種不同光照強度組菌藻生物膜優勢細菌門水平豐度分析

3 種不同光照強度組菌藻生物膜優勢細菌門水平的變化如表2 所示，由該表可知，本試驗中，不同光照強度下的菌藻生物膜細菌群落結構發育對不同的微生態環境有不同的響應。CK 組菌藻生物膜所含細菌種類表現為變形菌門（Proteobacteria）占絕對優勢，擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和放線菌門（Actinobacteria）其次，酸桿菌門（Acidobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）弱勢；隨著光照強度的增加，菌藻生物膜的優勢細菌類群所占百分比的次序發生了改變，T1 組變形菌門、擬桿菌門及綠彎菌門占優，藍細菌門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）和放線菌門其次，酸桿菌門、疣微菌門和硝化螺旋菌門弱勢；T2 組藍細菌門、擬桿菌門及綠彎菌門占優，變形菌門和浮霉菌門其次，放線菌門及酸桿菌門弱勢。

CK 組菌藻生物膜變形菌門豐度平均值為32.92%±2.65%，顯著高于T1 組（21.89%±3.25%）及T2組（15.28%±3.60%），表明光強對變形菌門有抑制作用，菌藻生物膜變形菌門的豐度隨著光照強度的增強而減少，差異顯著（P<0.05）；T1 組擬桿菌門豐度為18.72%±2.48%、T2 組擬桿菌門豐度為19.78%±4.69%，2組差異不顯著，CK 組擬桿菌門豐度為14.24%±1.89%，顯著低于T1 組和T2 組（P<0.05）；CK 組綠彎菌門豐度13.34%±3.73%，顯著低于T1 組（17.57%±3.57%）和T2組（18.77%±3.14%）（P<0.05）；CK 組及T1 組硝化螺旋菌門豐度分別為2.61%±0.53%和2.45%±0.34%，顯著高于T2 組（0.94%±0.1%）；T1 和T2 組放線菌門豐度水平沒有差異，但兩者與CK 組差異顯著；CK 組藍細菌門豐度（1.59%±0.52%），顯著低于T1 組（9.24%±1.2%）和T2 組（20.03%±1.03%），且后兩者差異顯著（P<0.05）。

在森林生態系統中，林隙通過控制林內光照強度[29-30]，影響微生物的代謝[26,28]，繼而微生物群落結構等對環境的變化產生響應。本次試驗得到了類似的試驗結果，隨著光照強度的改變，菌藻生物膜細菌群落優勢種在門水平豐度上有顯著差異。研究發現能將土壤中的亞硝酸氧化成硝酸鹽的硝化螺旋菌門（Nitrospirae）[31]在T1 處理和CK 處理中的相對豐度顯著高于T2 處理，具有污染物降解功能的芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）[32]在T1 處理中的相對豐度顯著高于CK 處理，CK 處理顯著高于T2處理，在證明3 個處理生物膜中存在不同程度的硝化過程，不同光照強度組菌藻生物膜細菌群落結構存在顯著差異，因對光照等需求的差異，不同光照強度形成的微生態環境對菌藻生物膜菌群的群落發育過程有重要的作用。

表2 3 個處理細菌群落門水平的組分豐度 Table 2 Component abundances at the gate level of three treatments

2.2.3 3 種不同光照強度組菌藻生物膜細菌優勢種屬水平豐度分析

為深入分析不同光照強度對菌藻生物膜細菌群落結構的影響，根據CK 組和T1、T2 3 個處理組的菌群群落屬相對豐度組成數據，通過與silva（SSU123）數據庫進行比對，共鑒定出480 個微生物屬，圖3 顯示了3 組處理細菌百分比大于1%的屬。由圖可知，CK 處理相對豐度最高的細菌為腐螺旋菌科（norank_f_Saprospiraceae（5.53%±0.62%），T1 處理相對豐度最高的細菌為紅桿菌屬（Rhodobacter，6.16%±1.38%），T2 處理相對豐度最高的細菌為分歧壺菌科（Cladochytriaceae，10.50%±1.38%）。

與微藻共培養的菌體能為微藻生長提供維生素[33-35]，還能固定無機營養素。Amin 等[36]報道，Scrippsiella trochoidea能夠利用細菌在環境中產生鐵載體，從而提高水處理效率。硝化是指硝化細菌在好氧的條件下首先將氨氮轉化為亞硝酸鹽氮（NO2-），生成的亞硝態鹽氮快速被亞硝酸鹽氧化菌轉化成硝酸鹽氮（NO3-）的過程；反硝化是指異養反硝化菌在缺氧條件下將亞硝酸鹽或硝酸鹽轉化成氮氣的過程，通過硝化和反硝化達到脫氮的目的，是重要的水污染控制技術之一[37]，本次試驗中，硝化螺菌屬（Nitrospira）在CK 組和T1 處理的屬水平相對豐度為2.72%±0.93%和2.57%±0.46%，顯著高于T2 組；3 個處理生物膜中存在大量的以Pseudomonas（假單胞菌屬）和Rhodobacter（紅桿菌屬）為主體的含有反硝化細菌的科屬，其中，假單胞菌屬中的部分種屬于好氧反硝化細菌[38]，這些菌在好氧條件下能夠以硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮為底物進行反硝化[39]，在本研究中，紅桿菌屬相對豐度隨著光照強度的增大而逐漸升高，T1 組假單胞菌屬的相對豐度平均值顯著高于CK 組及T2 組，可見T1組系統的硝化和反硝化功能優于CK 組及T2 組。

董怡華[40]研究發現菌株PSB-1D 在黑暗條件下比在光照強度4 000 lx 條件下對2-氯苯酚的7d 降解率高出12.12%；羅龍皂[5]進行不同光照強度下細菌降解廢水中有機物的試驗，結果表明：光照強度400 lx 是有機物降解菌適宜的工作條件。朱章玉等[41]報導PSB 在好氧黑暗條件下要比在厭氧光照條件下對有機酸具有更高的去除率和菌體得率。本試驗中，Paenarthrobacte是一種好氧生長的球形放線菌，可以利用多種碳源，并且可以水解淀粉類物質[42]，其在 CK 組的屬水平相對豐度為4.2%±1.07%，顯著高于T1 處理（3.56%±1.36%）和T2處理（1.59%±1.46%）；Ensifer（劍菌屬）是一種好氧生長的桿狀變形菌，能夠利用包括葡萄糖、半乳糖在內的多種碳源，不能水解淀粉，具有硝酸鹽和亞硝酸鹽還原能力，能夠附著在其他細菌表面并使其裂解，是一種非專性捕食性細菌[43]，劍菌屬在CK 組的屬水平相對豐度為4.6%±1.27%，顯著高于T1 處理（3.53%±1.25%）和T2 處理（1.87%±0.4%），說明CK 處理菌藻生物膜在降解多種有機物的能力方面強于T1 組和T2 組。

圖3 菌藻生物膜細菌優勢種屬水平群落組成分析 Fig.3 Community composition analysis of dominant species and genera of Bacillariophyta biofilm bacteria

3 結 論

1）對3 種不同的光照強度下的菌藻共生生物膜細菌群落進行了16S rDNA 測序，對結果進行了Alpha-多樣性分析，結果表明T1 處理和T2 處理的Alpha 多樣性指數，包括獲得的OTUs 數量（498.5±7.16、517.2±10.36）、Chao1 指數（648.7±35.64、672.8±30.69）和Shannon指數（4.68±0.01、4.85±0.03）均顯著高于CK 處理（406.6 ± 8.18，521.5±18.62，3.53±0.02），無光處理的菌藻生物膜的細菌群落在總體數量上處于弱勢，菌藻生物膜的細菌群落數量隨著光照強度的升高而增加。

2）對3 種不同的光照強度下的菌藻共生生物膜細菌群落進行了16S rDNA 測序，對結果進行了細菌優勢種門屬水平豐度分析，變形菌門（Proteobacteria），擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）和放線菌門（Actinobacteria）在3 個處理中均為優勢菌種，但豐度有顯著差異，CK 處理的酸桿菌門（Acidobacteria），T1處理的芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）及T2 處理的藍細菌門（Cyanobacteria）均具有較高豐度，且顯著高于其他兩組。不同光照強度下的菌藻生物膜細菌群落結構發育對不同的微生態環境有不同的響應，隨著光照強度的變化，菌藻生物膜的優勢細菌類群所占百分比的次序發生改變。T1 組具有較高水平的假單胞菌屬和硝化螺菌屬，擁有較高的硝化和反硝化能力，CK 組在劍菌屬水平顯著高于T1 組和T2 組，在降解多種有機物的能力方面較強。