復合菌系預處理稻稈半連續厭氧發酵產甲烷性能

潘云霞，劉思琪，賀亞清，向 陽

（西南大學工程技術學院，重慶 400715）

0 引 言

將秸稈厭氧發酵生產沼氣是提高農業廢棄物全量化和資源化利用的一種重要手段[1]。中國每年產生約10.4億t 秸稈，若將其進行厭氧發酵生產沼氣，不僅可解決焚燒帶來的環境污染問題，還可緩解當前日益嚴峻的能源短缺問題。秸稈由纖維素、半纖維素和木質素通過化學鍵相互交聯纏繞構成，這種致密結構會阻礙秸稈與微生物的接觸[2]，致使秸稈的水解酸化成為整個厭氧發酵的限速步驟，為此，需對秸稈進行物理、化學或生物預處理[3-8]。生物預處理因反應條件溫和、能耗低、易操作、環境友好等，備受研究者的青睞。

在生物處理中，單一菌易受產物抑制和發酵環境影響，造成產氣不穩定[9-10]，復合菌系由于菌群間良好的協同作用，能較好的克服這些問題[11-13]，黃開明等[11]利用復合菌HK-4 預處理玉米秸稈15 d，纖維素、半纖維素和木質素的降解率分別達到64.52%、51.06%和3.89%，沼氣產量較未接菌的對照提高了27.4%；祝其麗等[12]利用復合菌AMC 預處理玉米秸稈3 d，沼氣產量增加了6.89%；Sameh 等[13]利用復合菌處理木屑，沼氣產量較對照提高86.4%。因此，利用復合菌對木質纖維素進行生物預處理，能有效提高厭氧發酵的沼氣產量。但復合菌種類多，分泌的水解酶會導致發酵末端產物的多樣化。在厭氧發酵過程中，有70%～80%的甲烷來自于乙酸的轉化[14]，如果復合菌系能定向降解秸稈，使其轉化為易被產甲烷菌利用的底物，將對提高厭氧發酵中沼氣的品質具有重要作用。為此，實驗室從新疆多年連作的棉田土壤和牛糞、稻稈發酵液中，通過限制性培養篩選得到一株能高效降解稻稈的復合菌系，通過高通量測序，并結合宏基因組技術，對復合菌系高效降解稻稈產酸機制進行研究，并將其用于半連續厭氧發酵，以提高稻稈厭氧發酵效率和沼氣的品質。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復合菌系是由本實驗室從新疆多年連作的棉田和牛糞、稻稈發酵液中通過限制性培養方法篩選得到，使用前保存在-80℃冰箱。稻稈取自西南大學水稻研究所的試驗田，將自然風干稻稈在1%氫氧化鈉溶液中浸泡24 h，之后用自來水對浸泡稻稈反復沖洗，直至沖洗水的pH 值接近中性，將清洗后的稻稈置于80℃的鼓風干燥箱中進行干燥，之后剪成1 cm 的小段，存放在塑料袋中并置于干燥器中。蛋白胨纖維素培養基由蛋白胨5 g、NaCl 5 g、酵母提取物1 g 和CaCO32 g 構成。

1.2 試驗方法

在蛋白胨纖維素培養基中加入20 g 稻稈和1 000 mL去離子水，pH 值調節至9，121 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后，接種3%的復合菌系，生物預處理稻稈3 d 產生的揮發性脂肪酸（Volatile Fatty Acid，VFAs）和乙醇，經2 000 r/min 離心10 min，取上清液每天加入285.7 mL至2.5 L 厭氧發酵罐。厭氧發酵罐中接種體積比20%豬糞發酵沼液作為接種物，接種物中微生物通過16S rDNA 高通量測序，細菌以Clostridium、Terrisporobacter和Turicibacter為主，產甲烷菌以Methanosarcina和Methanobrevibacter為主。在預處理產酸階段，以單獨的蛋白胨纖維素培養基作為試驗的對照組，記為CK，在厭氧發酵產甲烷階段，以未添加復合菌的處理為對照組，記為CK，每組試驗設3 個重復。

1.3 試驗裝置

稻稈生物預處理厭氧發酵裝置如圖1 所示。試驗用1 L 的產酸發酵罐和2.5 L 的厭氧發酵罐，2 個發酵罐的瓶口都使用帶有玻璃導管的橡膠塞進行密封，采用水浴加熱，自動控制發酵溫度，進行為期40 d 的中溫（35±1）℃厭氧發酵，用集氣袋收集氣體，酸化并離心好的料液，在蠕動泵的作用下按照產甲烷相水力停留時間（Hydraulic Retention Time，HRT）7 d 定量輸送到厭氧發酵罐中產沼氣。

圖1 試驗示意圖 Fig.1 Schematic diagram of the experiment

1.4 分析方法

測定稻稈降解率時采用濾網過濾產酸發酵液，將殘留物85 ℃烘干稱質量，用減質量法計算出稻稈降解率[8]，纖維素、半纖維素和木質素的測定采用全自動纖維素測定儀（ANKOM2000i），pH 值采用pH 計（PB-10）測定，sCOD 采用COD 測定儀（DR1010）測定，產氣量用排水法測定，甲烷含量和VFAs 濃度采用氣相色譜儀（GC-2030）進行測定。稻稈組分、VFAs、pH 值和sCOD 每3 d 測定一次，產氣量和甲烷含量每天測定一次。

1.5 16S rDNA 高通量測序和宏基因組測序

將樣品10 000 r/min 離心5 min，棄上清液，剩余沉淀物按照試劑盒（FastPrep? Kits）說明書進行DNA提取，將檢測合格的DNA 樣品，選用細菌通用性引物 338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）和 806R （GGACTACHVGGGTWTCTAAT）進行PCR 擴增，16S rDNA 高通量測序。同時，對第3 天的發酵樣品用E.Z.N.A.? Kits 試劑盒進行DNA 抽提，通過Covaris M220將抽提到的DNA 進行片段化，篩選其中約300 bp 的片段進行PE 文庫的構建和宏基因組測序。高通量測序和宏基因組測序數據均使用上海美吉生工云平臺進行分析（https：//i-sanger.com）。

2 結果與分析

2.1 復合菌系預處理稻稈對稻稈組分和VFAs、乙醇的影響

復合菌系預處理中，稻稈及其各組分的變化如圖2所示。由圖2a 可以看出，復合菌系預處理稻稈的前3 d，稻稈的降解速度最快，在第3 天時，稻稈的降解率達到64.05%，纖維素和半纖維素的降解率分別達到61.02%和76.81%，最難降解的木質素，降解率也達到了20.31%，這比宋亞彬等篩選的復合菌系BYND-8，在稻稈達到相似降解率時的時間縮短了4 d[15]，此時，由于復合菌系對稻稈的降解，其致密結構被打破，稻稈的結構呈現松軟、蓬松狀態，其烘干后的表觀狀態呈現出多于第1 天的情況（圖2b）；復合菌系預處理稻稈6 d 后，纖維素和半纖維素降解速度減慢，稻稈的降解率也增加緩慢，到12 d時，大部分稻稈被復合菌系降解（圖2b），稻稈的降解率達到89.02%，是Wang 等篩選的復合菌系XDC-2 的2倍[16]，纖維素和半纖維素降解率分別達到80.51%和88.73%，木質素的降解率也到達了62.68%，這表明復合菌系具有強大的木質纖維素降解能力。

圖2 復合菌預處理稻稈時各組分的變化及降解效果 Fig.2 Components variation and degradation effect of rice straw bio-pretreated by microbial consortium

復合菌系預處理稻稈2 d，由于VFAs含量增加，pH值由9.0迅速降至6.2，第5天后，由于VFAs中乙酸、丁酸和戊酸含量逐漸降低，加之培養基中蛋白質的分解，使得pH值逐漸增加，在第7天達到7.5左右（圖3a）；而培養基中由于葡萄糖分解產生VFAs，使得pH值在前2 d由9.0降至7.0，隨后由于VFAs含量的降低和蛋白質的分解，使得pH值在2 d后稍有增加，在第7天時達到8.0左右（圖3b），這意味著該復合菌系具有一定的pH值調節能力。

圖3 復合菌預處理稻稈時pH 值、VFAs（Volatile Fatty Acids）的變化 Fig.3 pH value, VFAs concentration of bio-pretreated rice by microbial consortium

圖3 a 顯示，復合菌預處理稻稈過程中，乙酸在第1天就處于較高濃度，達到1 779.3 mg/L，并在第3 天達到最高值2 278.36 mg/L，隨后乙酸含量雖稍有下降，但始終保持在較高的濃度（1 400 mg/L 以上），遠高于對照組第2 天乙酸含量的最高值421.34 mg/L（圖3b）；丁酸和乙醇在稻稈生物預處理的初期，濃度都較低，隨著復合菌對稻稈預處理時間由1 d 增加到6 d，丁酸含量由423.76 mg/L 增加到1 485.89 mg/L，乙醇含量也由第1 天時的97.31 mg/L 增加到第5 天時的1 642.61 mg/L，隨后，這兩者的含量都開始逐漸降低，至第7 天時，丁酸和乙醇含量分別降至1 325.54 mg/L 和1 097.19 mg/L（圖3a），遠高于對照組丁酸在第2 天的最高值166.19 mg/L 和乙醇第1 天的最高值15.60 mg/L（圖3b）。本研究篩選的復合菌系，其乙酸（2 278.36 mg/L）和丁酸含量（1 485.89 mg/L）遠高于目前文獻報道的乙酸（1.5 g/L）和丁酸（0.6 g/L）濃度[17]，而且，復合菌預處理稻稈7 d，乙酸含量占總VFAs 的54.51%，丁酸含量占總VFAs 的29.02%，而丙酸和戊酸在整個稻稈生物預處理階段都保持較低的含量，僅占VFAs 的12.89%和3.58%。這說明復合菌系預處理稻稈是以乙酸和丁酸為主的丁酸型發酵。

2.2 復合菌系預處理稻稈的菌群結構及功能解析

由圖2 可知，復合菌系預處理稻稈的前3 d，稻稈的降解速度最快，已被產甲烷菌利用的乙酸也在第3 天達到最高值，故選擇第1 天和第3 天的微生物菌群進行分析，結果如圖4 所示。圖4 顯示，復合菌系預處理稻稈過程中，微生物在屬水平上第1 天和第3 天的優勢菌屬差異不大，主要為Cellulosilyticum、Prevotella、Pseudomonas、Mobilitalea、Lysinibacillus、Clostridium和Oscillibacter等；但第1 天和第3 天，各菌屬的相對豐度差異極顯著（P<0.001）。

圖4 復合菌系預處理稻稈第1 天和第3 天菌群在屬水平上的分類及顯著性分析（P<0.01） Fig.4 Classification and the significant difference analysis of 1d and 3d microbial consortium at genus level during rice straw bio-pretreated（P<0.01）

由于稻稈的主要成分為碳水化合物，通過物種（屬水平）與功能貢獻度分析發現，各菌屬都對碳代謝有最高的貢獻度，相對貢獻度均在45%以上，Lysinibacillus的相對貢獻度甚至達到了65.11%（圖5）。稻稈是由纖維素、半纖維素和木質素組成的復雜交聯結構，其中，纖維素是由D-葡萄糖通過β-1，4 糖苷鍵鏈接而成的長鏈高分聚合物[18]，半纖維素是由幾種不同類型的單糖（葡萄糖、木糖、甘聚糖、阿拉伯糖與半乳糖等）構成的異質多聚體[19]。在復合菌中，相對豐度在前 3 位的Cellulosilyticum、Prevotella和Pseudomonas都對糖酵解有非常高的相對貢獻度，分別達到了25.91%、21.99%和17.65%，其中，Prevotella對果糖、甘露糖代謝有最大的相對貢獻度，達到20.90%，而Cellulosilyticum對戊糖轉化具有最大的貢獻度，達到了11.98%（圖5），這意味著Cellulosilyticum和Prevotella都對纖維素和半纖維素有非常強的代謝能力。有研究表明，Cellulosilyticum和Prevotella可以將纖維素、纖維二糖、木聚糖和葡萄糖等降解轉化為以甲酸、乙酸為主的代謝產物[20-22]，而復合菌系中相對豐度前10 位的Mobilitalea、Clostridium和Ruminococcaceae，也能將纖維素、半纖維素和纖維二糖轉化為以乙酸、乙醇、丁酸等為主的代謝產物[23-24]，這使得本復合菌系在生物預處理稻稈初期，乙酸和丁酸就達到較高的濃度。木質素是復雜的芳香族多聚物，它通常是稻稈中最不易降解的組分。在復合菌相對豐度前三位的菌屬中，Pseudomonas對芳香族化合物的降解有最大的相對貢獻度，達到7.5%（圖5），這使得本復合菌系在生物預處理稻稈初期，就對稻稈有非常強的降解能力。

圖5 復合菌系的物種和功能貢獻度分析 Fig.5 Species and functional contribution analysis of microbial consortium

2.3 復合菌系預處理對稻稈厭氧發酵的影響

復合菌系預處理稻稈中，第3 天的乙酸含量最高，由于厭氧發酵中，70%～80%的甲烷來自于乙酸的轉化[13]，所以將稻稈生物預處理第3 天的酸液通過半連續方式進行厭氧發酵，結果如圖6 和圖7。由圖6 可知，在整個厭氧發酵過程中，試驗組的sCOD 和VFAs 濃度都遠高于對照。由于厭氧微生物需適應接種的發酵環境，這使得sCOD、VFAs 和乙酸的含量在發酵的前幾天都在逐漸增加，試驗組VFAs 和乙酸濃度在第6 天達到穩定，sCOD在第15 天達到穩定，而對照組的sCOD、VFAs 和乙酸含量均在第15 天達到穩定。無論試驗組還是對照，在整個40 d 的厭氧發酵中，丙酸、丁酸和戊酸的濃度幾乎保持不變。 屬Geobacter，但Methanosarcina 或Methanosarcina 有可能和其他菌互營降解乙醇和丁酸產甲烷，這使得厭氧發酵在進入穩定期后，雖然試驗組和對照組的日產氣量相差不大，但試驗組的甲烷含量和日甲烷產量都高于對照組。在第40 天的厭氧發酵中，試驗組的日甲烷產量始終保持在200 mL/d 左右，日產氣量、甲烷含量和日甲烷產量較對照分別增加了11.34%、25.24%和34.10%。

圖6 厭氧發酵中的VFAs 和sCOD 濃度變化 Fig.6 Variation of VFAs and sCOD concentration in anaerobic fermentation

圖7 厭氧發酵中的日產氣量、甲烷產量和甲烷含量 Fig.7 Daily biogas yield, methane yield and methane content in anaerobic fermentation

由于乙酸是產甲烷菌最易利用的底物，這使得厭氧發酵初期，試驗組的日產氣量、甲烷含量和日甲烷產量就遠高于對照，厭氧發酵前6 d，試驗組的平均日產氣量、甲烷含量和日甲烷產量分別較對照組增加了17.7%、68.9%和72.58%。在厭氧發酵中，始終未檢測到產酸階段出現的乙醇，根據Rotaru 等的研究，甲烷八疊球菌Methanosarcina barkeri可與G. metallireducens通過直接種間電子轉移（Direct Interspecies Electron Transfer，DIET）互營降解乙醇產甲烷[25]，而且，乙醇也能促進地桿菌屬Geobacter和甲烷絲菌屬Methanosaeta或甲烷八疊球菌屬Methanosarcina對丙酸和丁酸的互營降解[26]，在厭氧發酵中，丁酸含量由產酸階段第3 天的862.02 mg/L降至厭氧發酵階段的250 mg/L 左右，雖然在復合菌系和厭氧發酵接種物中均未發現G. metallireducens和地桿菌

3 結 論

1）復合菌系對稻稈進行預處理，稻稈的降解主要發生在前3 d，其降解率達到64.05%。復合菌系預處理稻稈12 d，稻稈的降解率達到89.02%，半纖維素、纖維素和木質素的降解率分別達到88.73%、80.51%和62.68%。

2）復合菌系預處理稻稈的代謝產物以乙酸和丁酸為主，乙酸和丁酸含量分別占總VFAs 的54.51%和29.02%，最高乙酸和丁酸含量分別達到 2 278.36 mg/L 和1 485.89 mg/L。

3）復合菌系主要由Cellulosilyticum、Prevotella、Pseudomonas、Mobilitalea、Lysinibacillus、Clostridium和Oscillibacter等組成，它們對碳代謝的相對貢獻度均在45%以上，其中，Prevotella和Cellulosilyticum對果糖、甘露糖代謝和戊糖轉化的相對貢獻度最大，達到20.90%和11.98%，Pseudomonas對木質素降解的相對貢獻度最大，達到7.5%。

4）復合菌系預處理稻稈半連續厭氧發酵產沼氣，日產氣量、甲烷含量和日甲烷產量分別較對照增加11.34%、25.24%和 34.10%，日甲烷產量始終保持在200 mL/d 左右。