大腸桿菌中三酶耦聯合成α-酮異戊酸

李雅婷，周麗，周哲敏

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

α-酮異戊酸(α-ketoisovalerate)在醫藥、食品、化妝品等領域應用廣泛[1]。α-酮異戊酸鈣是α-酮酸片的主要成分之一，適用于慢性腎病患者[2-3]；在飼料里加入α-酮異戊酸能有效刺激家畜的肌肉生長[4-5]；同時，α-酮異戊酸也是維生素B5的重要合成原材料[6]以及異丁醇合成過程中必不可少的中間體[7]。

目前，通過化學合成法和生物轉化法可合成α-酮異戊酸，其中又以化學合成法較為常見。然而，化學合成法工藝繁瑣且反應條件嚴苛，伴隨有毒副產物的產生，不適用于大規模工業生產[8]。生物轉化法以L-纈氨酸為底物在氨基酸脫氨酶和氨基酸氧化酶的催化下轉化為α-酮異戊酸[9]。利用氨基酸氧化酶法產α-酮酸在我國已實現工業化。然而，酶轉化法的效率較低，且反應過程中會有H2O2的生成，且難以除去[10-12]。利用發酵法生產α-酮異戊酸可以有效地消除有毒副產物的產生且成本更低，更利于環保。目前利用大腸桿菌發酵生產α-酮異戊酸的研究很少，所報道的大多數是利用谷氨酸棒桿菌為宿主菌進行α-酮異戊酸的發酵積累[13-15]。

在生物體中從頭合成α-酮異戊酸，必須共同表達多個關鍵酶。各酶在細胞內的均衡高效表達可使催化過程更協調，有利于促進目標產物的合成，因此選擇合適的共表達策略至關重要。目前在大腸桿菌中實現多酶共表達的策略主要有2種，包括多質粒共轉化系統和多順反子系統[16]。多質粒共轉化系統將基因分別置于不同的質粒中進行共同表達，因此表達基因的數量受到篩選標記和復制起點的可相容性等因素的限制，且有研究表明多個質粒共轉化后有的基因并沒有表達[17]。同時，多順反子系統將多個基因置于同一質粒中進行表達，存在基因的排列順序影響其表達水平的問題[18]。研究發現，應用多順反子載體在一個啟動子下游共表達2個基因，啟動子后面第2個基因編碼的蛋白質表達水平明顯弱于啟動子后第1個基因編碼的蛋白質[19]，為了解決這一問題，當需要控制不同基因的轉錄水平時，可以給每個基因添加獨立的啟動子，使每個基因都可以獨立轉錄[20]，同時也可以通過調節基因在質粒上的不同順序，平衡各個基因的表達水平。此外，不同的終止子對于mRNA的量有很大影響，并且終止子的效率與mRNA的量有一定的相關性[21]。添加有效的終止子也可以幫助基因進行正確的轉錄，以促進蛋白質的高效均衡表達[22]。

本研究通過克隆枯草芽孢桿菌來源的乙酰乳酸合成酶基因BsalsS、大腸桿菌來源的乙酰乳酸異構還原酶基因EcilvC和二羥基酸脫水酶基因EcilvD，構建了1株三酶串聯表達合成α-酮異戊酸的重組大腸桿菌。通過調整基因的排列順序、添加終止子等策略，對多個酶的平衡表達進行了調節，經體外轉化測定，篩選出1株最優的重組菌，并實現了發酵合成α-酮異戊酸，為以大腸桿菌為宿主生產α-酮異戊酸及其衍生物奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒與引物

菌株E.coliBL21(DE3)、E.coliDH5α、E.coliMG1655、B.subtilis168，質粒pETDuet-1由本實驗室保藏，質粒pUC-Term由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。本研究所用引物見表1，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 本研究所用引物

1.2 主要試劑與培養基

Prime Star max DNA聚合酶、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、Quick CutBamH I、HindIII、EcoR I、SacI、NotI、DNA Marker、Protein Marker(Broad)，寶生物工程(大連)公司；質粒提取試劑盒、純化試劑盒、抗生素、IPTG、丙酮酸鈉，生工生物工程(上海)股份有限公司；α-酮異戊酸，sigma。其他試劑為國藥試劑。

LB培養基(g/L):胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

2YT培養基(g/L):胰蛋白胨16，酵母粉10，NaCl 5。

M9-2培養基(g/L)：Na2HPO46, KH2PO43, NaCl 0.3，NH4Cl 1，酵母粉5，葡萄糖36，MgSO42 mmol/L,微量元素0.1%(體積分數)。

微量元素(g/L): FeSO4·7H2O 10.0，CuSO4·5H2O 3.0，MnSO4·4H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 5.25，(NH4)Mo7O240.1，Na2B4O7·10H2O 0.2，CaCl22.0，溶于 1 mol/L HCl 溶液中。

1.3 主要儀器

PCR儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀，BIO-RAD公司；UV-1 800 PC型紫外可見分光光度計，上海美普達有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；生物傳感儀，山東省科學院；高效液相色譜儀，日立(HITACHI)公司；Prevail Organic Acid 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),美國奧泰公司。

1.4 重組質粒的構建

1.4.1 不同基因順序質粒的構建

分別以B.subtilis168基因組、E.coliMG1655基因組為模板，以表1中P1+P2、P13+P14、P25+P26為上下游引物，克隆基因BsalsS、EcilvC、EcilvD。將質粒pETDuet-1與克隆基因用表1中對應的酶切位點進行雙酶切后，利用T4 DNA連接酶在16 ℃進行過夜連接，連接產物轉化至E.coliDH5α感受態細胞中，挑選陽性轉化子進行菌落PCR驗證，測序后得到重組質粒pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD。分別以pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD為模板，以表1中P3+P4、P15+P16、P27+P28為上下游引物，克隆片段PT7-BsalsS、PT7-EcilvC、PT7-EcilvD。將質粒pET-BsalsS與PT7-EcilvD用對應的酶切位點進行雙酶切后連接，得到重組質粒pET-BsalsS-EcilvD。同樣的方法可得到重組質粒pET-EcilvC-BsalsS、pET-EcilvC-EcilvD、pET-EcilvD-BsalsS、pET-EcilvD-EcilvC。分別以表1中P5+P6、P7+P8為上下游引物，以B.subtilis168基因組、質粒pET-EcilvC-EcilvD/pET-EcilvD-EcilvC為模板，獲得片段BsalsS與質粒骨架后進行吉布森組裝，得到重組質粒pCDS、pDCS。分別以表1中P17+P18、P19+P20為上下游引物，以E.coliMG1655基因組、質粒pET-BsalsS-EcilvD/pET-EcilvD-BsalsS為模板，獲得片段EcilvC與質粒骨架后進行吉布森組裝，得到重組質粒pSDC、pDSC。分別以表1中P29+P30、P31+P32為上下游引物，以E.coliMG1655基因組、質粒 pET-EcilvC-BsalsS為模板，獲得片段EcilvD與質粒骨架后進行吉布森組裝，得到重組質粒pCSD。各質?；蚺帕许樞蛉鐖D1所示。

圖1 不同基因排列次序的共表達策略

1.4.2 基因終止子的添加

分別以質粒pUC-Term、pCSD為模板，以表1中P21+P22、P23+P24為上下游引物，獲得片段EcilvC-Term與質粒骨架后進行吉布森組裝，得到重組質粒pCTSDT。分別以質粒pUC-Term、pCTSDT為模板，以表1中P9+P10、P11+P12為上下游引物，獲得片段BsalsS-Term與質粒骨架后進行吉布森組裝，得到重組質粒pCTSTDT(圖2)。

圖2 基因終止子添加策略

將重組質粒pET-BsalsS、pET-EcilvC、pET-EcilvD、pSDC、pCSD、pCDS、pDSC、pDCS、pCTSDT、pCTSTDT分別轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，得到重組菌S、C、D、SDC、CSD、CDS、DSC、DCS、CTSDT、CTSTDT。保存至-80 ℃冰箱中。

1.5 重組菌的誘導表達及最優菌株篩選

將保存至-80 ℃冰箱的重組菌株在含有100 μg/mL氨芐抗生素的LB固體培養基上劃線活化，挑取單菌落接種于含有100 μg/mL氨芐抗生素的5 mL LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養8 h，按照體積分數1%的接種量轉接至含有100 μg/mL氨芐抗生素的50 mL 2YT培養基中，與37 ℃、200 r/min培養至OD600約為0.8時，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG誘導，誘導溫度為30 ℃，誘導20 h后收集菌體。

離心收集菌體，調節菌體濃度OD600為40，用pH 7.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進行超聲破碎得粗酶液。將粗酶液統一稀釋8倍，利用Bradford法進行粗酶液的蛋白濃度測定并利用SDS-PAGE電泳分析目的蛋白表達情況。

體外轉化反應體系為1 mL，其中含有100 μL粗酶液，50 μL 1 mol/L丙酮酸鈉，10 μL TPP，10 μL NADPH，剩下的液體用pH 7.0的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液補足。置于30 ℃金屬浴中反應30 min后，于100 ℃煮沸10 min滅活，離心取上清液，檢測上清液中產物α-酮異戊酸的含量。

1.6 α-酮異戊酸的檢測

α-酮異戊酸的HPLC檢測條件[23]：色譜柱Prevail Organic Acid，流動相為pH 2.5、25 mmol/L的KH2PO4溶液，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，紫外檢測器波長210 nm，進樣量10 μL。

2 結果與分析

2.1 AlsS、IlvC、IlvD三酶耦聯表達體系的構建

以B.subtilis168基因組為模板克隆目的基因BsalsS，以E.coliMG1655基因組為模板分別克隆EcilvC、EcilvD基因，經瓊脂糖凝膠電泳驗證，目的條帶大小與理論值相符。電泳結果如圖3所示。

M-標準DNA;1-BsalsS;2-EcilvC;3-EcilvD

對重組菌S、C、D、SDC進行誘導表達。SDS-PAGE電泳(圖4)表明當3個基因分別單獨表達時，均能獲得明顯條帶；而當3個基因串聯表達時，3個蛋白表達量均有明顯的下降，且AlsS與IlvD大小相近，在SDS-PAGE電泳中并不能明顯地分開，IlvC由于在串聯體系的最末尾，表達量極低。

M-標準蛋白; 1-對照; 2-S; 3-C; 4-D; 5-SDC

對于多基因的共表達，通常需要選擇合適的共表達策略。KIM等[19]研究發現，當1個啟動子下游共表達2個以上的目的基因時，緊跟在啟動子后面的基因表達水平明顯高于遠離啟動子的基因表達水平，這可能是由于遠離啟動子的基因轉錄不完全而引起的。同時，PERRAKIS等[24]通過對多種基因共表達的研究表明，共表達的多個基因的DNA序列大小和組成也可能影響基因的表達水平。因此，基因順序的不同對于多基因是否能夠均衡表達有著相當關鍵的作用。接下來針對3個基因排列順序進行優化。

2.2 不同基因排列順序對三酶表達水平與催化性能的影響

對重組菌SDC、CSD、CDS、DSC、DCS進行誘導表達。對其蛋白表達量進行檢測，并以丙酮酸鈉為底物進行反應并測定產物α-酮異戊酸的合成水平，結果如圖5所示。

a-不同基因順序蛋白表達；b-不同基因順序蛋白濃度測定;c-不同基因順序α-酮異戊酸催化合成 1-對照; 2-SDC;3-DSC; 4-DCS; 5-CSD; 6-CDS

由SDS-PAGE圖(圖5-a)可以看出，重組菌CSD蛋白表達總量有明顯提升，且對粗酶液中的總蛋白濃度進行測定，也初步論證了這一點(圖5-b)。如圖5-c所示，重組菌CSD催化底物丙酮酸鈉生成0.40 g/L α-酮異戊酸，比優化前菌株SDC產量提高42.86 %。因此，基因在載體上的順序在很大程度上影響基因的表達及催化效率，這與之前的文獻報道[19]相符。選擇重組菌株CSD作為后續研究菌株。

雖然經過基因順序優化之后，產量有了明顯的提升，但是其總產量卻仍然很低，猜測多基因串聯在表達水平上彼此存在競爭關系，雖然已經盡量對多基因的表達進行協調，但還是存在轉錄水平不完全、表達不均衡等問題。針對這個問題，我們決定對表達較弱的相關基因通過添加終止子的策略進行完整的表達體系構建。

2.3 添加終止子對三酶表達水平與催化性能的影響

對重組菌CTSDT、CTSTDT進行誘導表達。比較添加不同終止子的蛋白表達效果及體外轉化效率， SDS-PAGE圖(圖6-a)及粗酶液的蛋白濃度測定(圖6-b)結果顯示，添加了終止子后，重組菌CTSDT的蛋白總量有了明顯的提升。體外轉化結果如圖6-c所示，當EcilvC添加終止子，α-酮異戊酸產量有了明顯提升，為0.91 g/L，對比未加終止子前的0.40 g/L，α-酮異戊酸產量提高了1.28倍。

a-添加終止子蛋白表達; b-蛋白濃度測定;c-添加終止子α-酮異戊酸催化合成 1-對照; 2-CSD; 3-CTSDT; 4-CTSTDT

通過添加終止子策略對基因實現精細化調控是較為常見的調控手段。WANG等[22]通過對266種終止子轉錄效率的研究表明，添加有效的終止子可以幫助基因進行正確的轉錄，形成更加穩定的mRNA，從而實現對基因的精細化調控。MAIRHOFER等[25]通過在E.coli中添加不同的T7終止子組合，有效地提高了終止子的終止效率。本研究中由于基因EcilvC表達量不高，通過添加了終止子提高其終止效率，轉錄形成更多正確的mRNA，從而有效地提高了產物α-酮異戊酸的產量。于是，選擇重組菌株CTSDT作為后續的研究菌株。

2.4 α-酮異戊酸發酵合成

利用體外粗酶液轉化需要外源添加輔酶TPP與NADPH，操作繁瑣且成本較高，而通過發酵法利用菌體自身代謝實現產物α-酮異戊酸的積累是一個較為簡單且有效的方法。于是，在質粒構建優化完成后，我們利用M9-2培養基，對重組菌株CTSDT進行搖瓶發酵驗證。在發酵過程中，每間隔4 h進行取樣并同時調節pH在7左右。結果如圖7所示，當發酵16 h時，α-酮異戊酸的產量達到1.70 g/L，與未經過改造的重組菌SDC相比較，提升了3.36倍。而在接下來的培養過程中，α-酮異戊酸產量有所下降，因為α-酮異戊酸是多條代謝途徑的中間產物[26]，猜測可能是α-酮異戊酸在體內被進一步消耗生成其他代謝物。

圖7 重組菌發酵合成α-酮異戊酸驗證

利用大腸桿菌發酵生產α-酮異戊酸，與傳統的酶法轉化氨基酸生產α-酮異戊酸相比，具有更加綠色環保且高效等優點。LI等[12]通過酶法轉化L-纈氨酸生成α-酮異戊酸，反應16 h僅生成0.56 g/L α-酮異戊酸，本研究僅通過優化了關鍵代謝途徑的基因表達，利用大腸桿菌發酵16 h可生成1.70 g/L α-酮異戊酸，極大地提高了產物的產量，且發酵過程中不會產生H2O2等毒副產物，方便后續提取分離。

3 結論

本研究通過克隆α-酮異戊酸合成過程的3種基因，在大腸桿菌體內過表達了該途徑。通過優化3個基因的排列順序和終止子添加方式，獲得了最優菌株CTSDT。重組菌株CTSDT體外催化合成α-酮異戊酸水平為0.91 g/L；以葡萄糖為碳源發酵16 h 可獲得1.70 g/L α-酮異戊酸，比未優化前的菌株SDC產量提高了3.36倍。在接下來的研究中，將嘗試敲除α-酮異戊酸的進一步消耗途徑基因，如ilvE、panB等，以實現產物α-酮異戊酸的高效發酵合成。本研究實現了在大腸桿菌中發酵法生產α-酮異戊酸，為大腸桿菌發酵法生產α-酮異戊酸提供了研究思路。