Microbio方法與平板計數方法在菌落計數中的比較

郭佳，王娉，周繼福,3，趙曉美，劉繼鋒，陳穎*

1(中國檢驗檢疫科學研究院，北京,100176) 2(天津科技大學 食品科學與工程學院，天津,300457) 3(南京財經大學 食品科學與工程學院，江蘇 南京,210046)

菌落總數是指食品樣品經過處理，在一定條件下培養后所得每克(或每毫升)樣品中形成的微生物菌落數[1]，是評價食品衛生情況的重要性指標。目前檢測食品中菌落總數的方法有顯色培養基法、測試紙片法、電阻抗技術法、ATP生物發光技術法、流式細胞術檢測法和自動化儀器分析方法等。其中，顯色培養基法實驗步驟較傳統方法簡單[2-3]，結果更易判讀[4]；測試紙片法方便快捷[4-5]，但成本較傳統培養法高[6]；電阻抗法目前已被美國分析化學家協會 (Association of Official Analytical Chemists，AOAC)認證[6]，但電阻抗儀對溫度的穩定性要求較高[7-8]，使用時需注意環境溫度；ATP生物發光技術法操作快速簡單、測定范圍廣[9]，但菌落濃度一般需≥104CFU/g[10]；流式細胞術檢測法大多應用在液體樣品中，固體樣品的應用還較少[11]；自動化儀器檢測法雖然儀器本身成本偏高，但操作簡單，可以大大降低人工成本，適合大批量檢測。

Microbio全自動菌落計數法是運用透鏡像差多重聚焦技術對菌落進行3D分析，能夠連續動態監測并有效區分雜質，快速完成菌落計數。為探究Microbio 全自動菌落計數法與平板菌落計數法在檢測結果上是否有顯著性差異，本文分別用上述2種方法檢測模擬染菌的食品樣品，從數據準確度、定量限和檢出時間等方面進行分析比較。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

微生物數碼顯微培養計數系統(MicroBio)，BD；麥氏濁度儀(M007230)，Biomerieux；培養箱(BD115)，Binder；培養箱(IC160)，Salvis。

1.2 菌種與樣品

大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC11775，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)22018，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853，洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)CICC10857，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)1410302，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)22730，白色念珠菌(Moniliaalbican)ATCC90029，黑曲霉菌(Aspergillusniger)ATCC16404，領地伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaterritorii)IQCC33107，污染伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacontaminans)CICC23882均為本實驗室保存。食品樣品(生雞肉)，購自北京超市，經高溫滅菌后備用。

1.3 試劑與耗材

平板計數瓊脂(plate count agar, PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司和BD公司；腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)、腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar, BHIA)，Oxoid公司；NaCl，國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂、比濁管，BD公司；2 mL離心管，AXYGEN公司；50 mL離心管，美國康寧公司。

1.4 方法

1.4.1 檢測數據準確性及定量限比較

分別制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉的菌液。

用生理鹽水將菌液調節到適當的濁度后加入到食品樣品中，制成菌落終濃度為100、50、25、10、5 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液，采用GB 4789.2—2016[1]、GB 4789.15—2016[12]中的方法進行檢測。隨后分別放入普通培養箱(PT組)和微生物數碼顯微培養計數系統(TD組)進行培養。每組5個重復。空白對照為未添加目標菌的食品樣品。采用t檢驗進行統計，P<0.05認為差異具有統計學意義。

制備5份不同濃度:1、5、10、15、20、25 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液，培養和檢測方法同上。采用t檢驗進行統計，P<0.05認為差異具有統計學意義。

1.4.2 檢出時間比較

分別制備領地伯克霍爾德氏菌、污染伯克霍爾德氏菌食品樣品模擬污染懸液，污染濃度≤100 CFU/mL。培養方式及空白對照同1.4.1。采用t檢驗進行統計，P<0.05認為差異具有統計學意義。

1.4.3 不同操作人員比較

為探究人員操作對于計數結果的影響，以不同人員為單一變量，在其他條件不變的情況下，分別制備5、10、25、50、100 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液(大腸埃希菌)，實驗由2人進行操作，各做5組，平行5次實驗，具體操作及空白對照同1.4.1。

1.4.4 不同品牌培養基比較

用BD公司和北京陸橋公司的培養基進行金黃色葡萄球菌的培養操作，各做5組實驗，前期處理和后續檢測培養操作及空白對照同1.4.1。對計數結果進行單因素方差分析(α=0.05)。

1.5 數據處理方法

采用Excel及Minitab 17進行數據處理，對數據進行雙樣本t檢驗及單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 數據準確性及定量限比較

根據1.4.1步驟對8個菌種(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉)進行數據準確性比較實驗，空白對照無目標菌檢出，回收率70%～105%，相對標準偏差(relative standard deviation, RSD) 0.04～0.35，說明數據準確度較好[13-14](表1)。5 CFU/mL時，RSD均≤0.35；10、25 CFU/mL時，RSD≤0.25；50、100 CFU/mL時，2個方法的RSD≤0.15。其中PT組RSD高于TD組RSD的比例為50%，這說明在數據穩定性上，TD組較PT組有微小的優勢。在相對標準偏差方面，5、10 CFU/mL的RSD大多在0.20～0.35之間，這在一定程度上說明低濃度(5、10 CFU/mL)的平板計數誤差較大。運用Minitab軟件對數據進行方差分析(α=0.05)，得到的P>0.05，說明2者在統計學上差異不顯著，Microbio全自動菌落計數法可以替代平板計數法。

表1 兩種培養方法下8株菌菌落計數的數據 準確性結果比較

續表1

為確定TD組的檢測結果是否可靠，對PT組和TD組的數據進行相關性分析。以PT組數值為橫坐標，TD組數值為縱坐標，對數據進行線性回歸，得到的相關系數在0.969 6～0.997 4之間，且都大于0.95，具有良好的相關性，表明Microbio 全自動菌落計數法的測定結果可靠。

為確定Microbio全自動菌落計數法和平板計數的定量限是否存在差異，選擇6個較低檢測濃度進行檢測。空白對照無目標菌檢出。當菌體濃度在1 CFU/mL時，2種方法的回收率都較低。5～25 CFU/mL時，回收較高，在72%～101%之間。對數據進行方差分析(α=0.05)，P值在0.107～1.000之間(≥0.05)，表明2種方法差異不顯著。定量限均可以達到 5 CFU/mL。

表2 兩種培養方法下8株菌菌落計數的定量限結果比較

續表2

續表2

2.2 檢出時間分析

污染伯克霍爾德氏菌[15]和領地伯克霍爾德氏菌生長緩慢[16]，檢測一般需要1～2 d。因此選用上述2株菌評價2種方法的最快檢出時間。TD組的檢出時間可以精確計時到0.5 h。空白對照無目標菌檢出。污染伯克霍爾德菌16.0 h左右即可被 Microbio全自動菌落計數系統檢出，20.0 h左右計數穩定(圖1-a)；領地伯克霍爾德菌15.5 h左右可被檢出，19.0 h左右計數穩定(結果未顯示)；而平板計數法24 h左右才能檢測到領地伯克霍爾德氏菌(結果未顯示)和污染伯克霍爾德氏菌穩定計數結果(圖1-b)。因此，從檢測時間看，Microbio 全自動菌落計數法短于傳統的平板計數法。

A-TD組；B-PT組

2.3 人員操作對于計數結果的影響

選用大腸埃希菌作為實驗菌種，以操作人員(A、B)為單一變量，設計10組實驗研究人員操作對于計數結果的影響。空白對照無目標菌檢出，實驗組10組數據的P值均>0.05(0.160～0.921之間)(表4)，說明不同人員操作對計數結果影響不顯著。

表4 不同人員對于計數影響的單因素方差分析(大腸埃希菌)

2.4 不同培養基對于計數結果的影響

圖2是使用不同廠家培養基所得的計數結果圖，a為TD組結果，b為PT組結果。1號為X廠家培養基，2號為Y廠家培養基，右下角為菌落計數結果，分別為73、98、95、115 CFU(空白對照無目標菌檢出)。PT組和TD組分別有5個水平，每個水平的平行數為5，計數結果方差分析(α=0.05)顯示，2種培養基在統計學上沒有顯著性差異。說明不同培養基對計數結果影響不大。

a-Microbio方法；b-平板計數法;1-X廠家培養基；2-Y廠家培養基

3 討論與結論

本研究共選用10種代表菌株，分別從計數數據準確性、定量限檢測、檢出時間、人員操作、不同培養基方面對Microbio全自動菌落計數法和平板計數法進行比較。實驗結果表明，全自動菌落計數法在計數數據準確性、定量限檢測、人員操作、不同培養基方面和平板計數法無統計學差異(α=0.05)，最低檢出限可達5 CFU/mL；檢出時間方面，全自動菌落計數方法相較于平板計數法有一定的優勢，節約4 h左右。

在菌種選擇方面充分考慮了代表性，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別作為革蘭氏陽性菌[17]和革蘭氏陰性菌代表[17]，蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是污染食品中常被檢測到的芽孢桿菌[18]，選取銅綠假單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌來檢測色素是否會影響機器的計數，選取黑曲霉和白色念球菌來評價機器真菌計數[19]的效果。

食品加工過程復雜多樣，冷凍、鹽漬、高溫等加工方法可使部分菌株因細胞結構受損而死亡，但也存在一部分菌株能夠抵御這些不良環境因素，而處于受損傷或亞致死狀態，在這種情況下進行檢測時，應合理地考慮培養基的使用效果。本研究發現，進口培養基和國產培養基在數量上沒有顯著性差異。從菌落的形態來看，X廠家培養基上生長的菌落較Y廠家培養基的稍大。因此在檢測敏感性較高的菌種時，應根據菌種的長勢選擇合適的培養基[20]。

在檢出時間方面，自動化的儀器設備要優于傳統的檢測方法。傳統的檢測方法，需要每間隔一定的時間就對菌落進行計數，并且受菌落大小及透明度的限制，十分耗費人力。而Microbio全自動菌落計數法可以實現實時檢測，實時計數，操作更智能，還能將數據實時傳輸至工作者的郵箱，因此全自動菌落計數法在檢出時間方面有一定的優勢。

自動化檢測是微生物快速檢測的一個趨勢，隨著勞動力成本的上升和儀器成本的降低，越來越多的自動化檢測技術應用于菌落計數中，如TSUTA等[21]和RAYMOND等[11]分別用流式細胞術法來提高好氧平板計數法的預測精度及檢測巧克力中乳酸菌的總數，LUCAS等[22]結合3D打印技術檢測液滴中大腸桿菌的數量，JIANG等[23]采用電化學傳感器的方法檢測水中的菌落總數。利用全自動菌落計數法不僅可以節省勞動力，還可以降低實驗員主觀上對于菌落計數結果的影響，使結果更客觀。目前關于Microbio 微生物數碼顯微培養計數系統的相關文獻研究較少，但國內已有一些原理相似的儀器出現，如QXC-30(上海海恒機電)及訊數公司的一系列儀器，說明該方法在菌落計數方面有較大的潛能。