不同類型豆豉抗氧化活性差異與影響因素分析

陳怡，陸敏捷，劉洋，蔣立文，李跑，廖盧艷

1(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙，410128) 2(食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué))，湖南 長沙，410128)

豆豉是一類歷史悠久的發(fā)酵豆制品，擁有獨(dú)特的風(fēng)味和較高的食用、藥用價(jià)值[1]，深受消費(fèi)者喜愛。豆豉以大豆或黑豆為主要原料，在多種微生物的共同作用下發(fā)酵，產(chǎn)生活性肽、大豆低聚糖、大豆異黃酮、類黑精等一系列活性物質(zhì)[2-3]，使豆豉具有抗癌、抗氧化及促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)等生理活性[4-6]。

氧化應(yīng)激被認(rèn)為是造成許多慢性疾病如心血管疾病、糖尿病等的重要因素[7]，而食物中的抗氧化成分可以減少氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷，從而防止由自由基損傷導(dǎo)致的相關(guān)疾病[8]。大豆含有多種天然抗氧化成分如多酚、VC、異黃酮等[9-10]，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。其中，大豆異黃酮是人們研究最多的物質(zhì)，目前已發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮共有12種，大豆及普通大豆食品中的異黃酮主要是以糖苷形式存在(占97%～98%)。在發(fā)酵過程中，微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶使豆豉中大豆異黃酮構(gòu)成發(fā)生轉(zhuǎn)變，生成大豆異黃酮苷元[11]。研究發(fā)現(xiàn)，A環(huán)上的酚羥基越多，其抗氧化作用越強(qiáng)，因此苷元型異黃酮較糖苷型具有更強(qiáng)的抗氧化活性[12]。XU等[5]研究表明大豆制品在發(fā)酵期間，大豆中糖苷型異黃酮有向苷元型轉(zhuǎn)換的趨勢，且豆豉經(jīng)過發(fā)酵后，抗氧化活性增加[13]。

豆豉的分類方法有多種，按照加工原料可分為黃豆和黑豆豆豉；根據(jù)腌制口味可分為淡豆豉、咸豆豉和酒豆豉3種；豆豉還可以根據(jù)發(fā)酵微生物的不同分為毛霉型、曲霉型、根霉型和細(xì)菌型[14]。由于不同優(yōu)勢微生物菌群發(fā)酵的豆豉產(chǎn)酶能力的差異，豆豉在發(fā)酵過程中大豆異黃酮由糖苷型向苷元型轉(zhuǎn)化程度也不同[15]，最終導(dǎo)致其抗氧化活性出現(xiàn)差異。此外豆豉發(fā)酵的原料、工藝、環(huán)境等均會(huì)對其抗氧化活性造成影響[16-18]。為了解不同類型豆豉在抗氧化活性方面的差異以及影響因素，通過比較10種不同品牌豆豉(2種細(xì)菌型、5種曲霉型以及3種毛霉型豆豉)的總抗氧化能力、羥基自由基(·OH)清除率以評價(jià)抗氧化能力的差異，并通過測定總多酚、大豆異黃酮及各組分探究導(dǎo)致各豆豉抗氧化能力差異的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福林酚, 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；沒食子酸、大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司；乙腈、二甲基亞砜，色譜純；其余試劑均為分析純；總抗氧化試劑盒(T-AOC)，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY220微量分析天平，島津公司；Agilent 1100 series高效液相色譜儀，安捷倫；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Thermo Scientific Multiskan FC全波長酶標(biāo)儀，上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；H-2050R高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼公司；KQ3200E超聲波振蕩器，上海五相儀器儀表有限公司；KHW-S-4電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品來源

樣品豆豉均為發(fā)酵成熟適當(dāng)脫水后的純豆豉樣品，其中細(xì)菌型2種、曲霉型5種、毛霉型3種，因?yàn)楦剐椭饕怯∧岬牡へ愃詻]有采購到相應(yīng)樣品。各樣品經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎，過80目篩，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 豆豉樣品清單

1.3.2 pH值

按照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品酸度的測定》進(jìn)行測定。

1.3.3 總氨基酸含量

樣品處理：以m(豆豉物料)∶m(蒸餾水)=1∶10的比例超聲30 min，8 000 r/min，離心15 min，取上清液備用。提取液按照國標(biāo)GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》進(jìn)行測定。根據(jù)水溶性蛋白含量等于水解氨基酸含量之和，計(jì)算出水溶性蛋白含量。

1.3.4 水解度

樣品中的氨基酸態(tài)氮含量測定采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》；總氮含量按照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》。按照公式(1)計(jì)算水解度:

(1)

1.3.5 總多酚的測定

樣品處理：以m(豆豉物料)∶m(體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶液)=1∶10的比例超聲30 min，8 000 r/min，離心15 min，取上清液備用。

采用Folin-酚比色法進(jìn)行測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取沒食子酸25 mg溶解于100 mL蒸餾水中。分別取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于5支比色管中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為10%的Folin-酚試劑2.5 mL和7.5 g/mL Na2CO3溶液2 mL，加水定容至10 mL。在45 ℃水浴中反應(yīng)15 min，波長765nm處測定其吸光度。樣品測定：取提取液1 mL，按上述步驟操作，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=4.172x+0.103 8,R2=0.995 4。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

1.3.6 大豆異黃酮的測定

1.3.6.1 樣品處理

分別稱取10種豆豉樣品粉末0.4～0.5 g，分別加入體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液溶解后超聲20 min，定容至50 mL。搖勻后于8 000 r/min離心15 min。取上層清液過0.45 μm針孔式濾膜備用。

1.3.6.2 色譜條件

Agilent C18色譜柱 250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相A乙腈與流動(dòng)相B磷酸水溶液(pH 3.0)梯度洗脫詳情見表2；流速1.0 mL/min；波長260 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

表2 梯度洗脫參數(shù)

1.3.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配制6種400 mg/L單標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別配制成8.0、16.0、24.032.0、40.0 mg/mL五種不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以下是各標(biāo)品的出峰時(shí)間以及標(biāo)準(zhǔn)曲線：大豆苷(14.586 min)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=39 269x-10 463，R2=0.999 7；大豆黃苷(15.653 min)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=37 741x-10 470,R2=0.999 5；染料木苷(20.811 min)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=54 862x-31 384，R2=0.999；大豆素(31.261 min)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=62 736x-33 920，R2=0.998 3；大豆黃素(32.747 min)y=50 738x-26 673，R2=0.999；染料木素(40.908 min)y=83 819x-87 887，R2=0.996 6。

1.3.7 羥自由基(·OH)清除率的測定

測試管吸光度(A1)：5 mol/L的鄰苯二氮菲溶液1.5 mL，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液2.0 mL，混勻后，加入7.5 mol/L的FeSO4溶液1.0 mL，混勻后再加入1.0 mL/L的H2O21.0 mL，以蒸餾水補(bǔ)充至10 mL， 37 ℃水浴保溫1 h，在波長510 nm處測定吸光度。對照管吸光度(A0)與上述方法差別在于不加H2O2和提取物。試樣溶液管吸光度(A2)：在測試管測完后分別加入各豆豉提取液1 mL。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。按公式(2)計(jì)算清除率：

(2)

1.3.8 總抗氧化能力測定

按照T-AOC試劑盒說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定豆豉提取液的總抗氧化能力，依據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算出總抗氧化能力值相當(dāng)于其數(shù)值倍的Trolox。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)平行測定3次，采用Excel 2003、Origin 9.0、SPSS軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析、相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 基礎(chǔ)指標(biāo)測定

由表3可知，不同優(yōu)勢菌群發(fā)酵豆豉的pH、水溶性蛋白含量及水解度均具有明顯差異。其中pH高低順序?yàn)椋杭?xì)菌型納豆>毛霉型豆豉>曲霉型豆豉。2種細(xì)菌型豆豉B-Y和B-H的pH明顯高于其他豆豉樣品，其中以B-Y的pH最高(7.1±0.01)，毛霉型豆豉的pH均大于5.20，較曲霉型豆豉稍高。這與邵良偉等[19]認(rèn)為傳統(tǒng)霉型豆豉是在酸性環(huán)境下制曲的結(jié)論相符。

表3 不同類型豆豉的pH、水溶性蛋白含量及水解度

豆豉的水溶性蛋白含量與水解度均可反映蛋白質(zhì)的水解程度，可作為判斷豆豉成熟的標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌型B-Y和B-H的水溶性蛋白含量明顯高于其他類型豆豉，且均大于20%。曲霉型豆豉中A-TPQ、A-LFR、L-YHF的水溶性蛋白質(zhì)含量均為165 mg/g左右，而其他2種A-YLY、A-DXY相對較低。毛霉型豆豉的水溶性蛋白含量差異較大，其中以M-YC最低，為(71.2±0.14)mg/g。所有豆豉中以細(xì)菌型納豆B-H的水解度最高，為(34±3.96)%，毛霉型豆豉M-YC則為水解度最低樣品，水解度為(2.7±0.13)%，其變化趨勢與水溶性蛋白含量一致。

納豆發(fā)酵過程中，納豆芽孢桿菌菌體增殖速度快，能夠迅速產(chǎn)生大量蛋白酶引起蛋白質(zhì)的降解[20]，這可能是導(dǎo)致納豆的水溶性蛋白質(zhì)含量及水解度較高的原因；同時(shí)，霉菌型豆豉發(fā)酵工藝中的洗霉工序會(huì)引起水溶性蛋白流失，導(dǎo)致水溶性蛋白含量偏低。此外，由于不同廠家的豆豉生產(chǎn)工藝上存在差異，如洗霉、曬制、蒸煮程度、添加輔料種類以及發(fā)酵時(shí)間都會(huì)影響水溶性蛋白質(zhì)含量及pH的變化[21-22]。

2.2 豆豉的總酚和大豆異黃酮含量

2.2.1 總多酚含量

由圖2可知，B-Y、B-H兩種細(xì)菌型納豆總多酚含量明顯低于其他類型豆豉(除M-YC外)，這可能與納豆以黃豆作為原料，而其他豆豉多以富含花色苷及總酚的黑大豆為原料[23]有關(guān)。曲霉型豆豉的5種樣品中A-TPQ、A-DXY、A-LFR的總酚含量接近，其中以A-TPQ含量最高，為(57.2±0.03) mg/100 g，而A-YLY、A-YHF的總酚含量較同類型豆豉稍低。毛霉型豆豉中除M-YC的多酚含量最低為(21.8±0.05) mg/100 g外，M-YJJ(71.9±0.91) mg/100 g及M-HY(67.5±1.52) mg/100 g的多酚含量均在所有豆豉中較高。

圖2 不同類型豆豉的總多酚含量

2.2.2 大豆異黃酮含量

未發(fā)酵大豆中的大豆異黃酮主要為糖苷型的大豆苷、大豆黃苷、染料木苷，在發(fā)酵過程中，由于微生物能夠分泌β-葡萄糖苷酶，將異黃酮糖苷水解為具有更強(qiáng)抗氧化活性的異黃酮苷元[15]。但由于不同類型豆豉中主要微生物不同，轉(zhuǎn)化程度有所差異，詳見圖3、表4。

表4 不同豆豉的大豆異黃酮含量 單位：mg/kg

圖3 不同豆豉中糖苷型和苷元型大豆異黃酮總含量

由圖3可知，在所有豆豉樣品中，M-YC的大豆異黃酮總含量最低，為(1 214.4±9.32) mg/kg，M-HY最高，為(3 377.3±20.6) mg/kg，其次為同類型豆豉M-YJJ。細(xì)菌型豆豉(B-Y、B-H)雖然大豆異黃酮總量不低，但兩者的苷元型異黃酮僅占總量的20.73%和20.30%，其中B-H的苷元型異黃酮含量在所有樣品中最低，為(453.7±0.81) mg/kg。5種曲霉型豆豉的苷元型大豆異黃酮占比均>82%，其中A-TPQ、A-DXY、A-YHF的占比超90%。毛霉型豆豉中M-HY的苷元型異黃酮含量在所有樣品中最高，為(32 925.4±12.33) mg/kg，其占比達(dá)到86.62%。

2.3 豆豉的總酚和大豆異黃酮含量

由表5可知，細(xì)菌型納豆B-Y和B-H的抗氧化活性接近，且明顯弱于毛霉型和曲霉型豆豉，以B-H的總抗氧化能力(0.1±0.04) mmol/L和·OH清除率(5.4±0.04)%最低。在霉型豆豉中，M-HY的總抗氧化能力最高，為(0.6±0.08) mmol/L，A-DXY的·OH清除率最大，為(65.3±0.62)%，而A-YHF的·OH清除率與總抗氧化能力均為霉型豆豉中最低。

表5 不同豆豉的總抗氧化能力和·OH清除率

納豆抗氧化活性顯著弱于霉型豆豉，可能是因?yàn)榧{豆是在黃豆中接種納豆芽孢桿菌進(jìn)行純種發(fā)酵，而中國傳統(tǒng)豆豉(曲霉型以及毛霉型豆豉)均屬于混菌發(fā)酵。吳蘭芳等[24]研究自然發(fā)酵豆豉與純種發(fā)酵豆豉的抗氧化活性，結(jié)果表明，自然發(fā)酵豆豉抗氧化性>純種發(fā)酵豆豉。此外，不同類型豆豉的抗氧化能力(表5)與多酚及大豆異黃酮含量(圖2，表4)變化趨勢較為一致，說明抗氧化活性物質(zhì)(多酚及大豆異黃酮)含量的差異也可能是導(dǎo)致豆豉抗氧化活性差異的重要因素。為進(jìn)一步論證豆豉抗氧化能力的影響因素，對不同類型豆豉的抗氧化能力及多酚含量、異黃酮含量進(jìn)行了相關(guān)性分析。

2.4 抗氧化活性與多酚、大豆異黃酮的相關(guān)性分析

表6中采用Pearson’s相關(guān)性系數(shù)分析了10種不同來源的豆豉中抗氧化活性與總多酚、大豆異黃酮總含量以及大豆異黃酮苷元含量等的相關(guān)性。

表6 ·OH清除率、總抗氧化能力與總多酚和苷元型大豆異黃酮含量的相關(guān)性分析

結(jié)果表明，·OH清除率、總抗氧化能力與總多酚、大豆異黃酮苷元含量極顯著(P<0.01)相關(guān)，但與大豆異黃酮總量相關(guān)性較低，說明總多酚、苷元型大豆異黃酮含量的變化是導(dǎo)致不同類型豆豉抗氧化能力差異的重要原因。其中，大豆異黃酮苷元含量與·OH清除率、總抗氧化能力的相關(guān)性較總多酚更強(qiáng)，分別為0.803和0.853，說明苷元含量對豆豉抗氧化活性的影響更大。CHUNG等[13]也認(rèn)為豆豉發(fā)酵過程中苷元型異黃酮以及總多酚的含量增加是導(dǎo)致其抗氧化能力增強(qiáng)的主要原因。同時(shí)，總多酚、苷元含量與總抗氧化能力的相關(guān)性較·OH清除率更大，說明多酚和苷元含量對總抗氧化能力影響更大。此外，pH與·OH清除率及總抗氧化能力呈負(fù)顯著相關(guān)(P<0.05)，其中與·OH清除率的相關(guān)性為-0.782，表明pH對豆豉的·OH清除活性的抑制更大。朱新鵬等[25]對黑蒜提取物做抗氧化研究亦發(fā)現(xiàn)pH>7以上的環(huán)境中，抗氧化活性下降快。除了上述原因外，抗氧化能力也受到其他因素的影響，如曲霉型和毛霉型豆豉發(fā)酵過程中產(chǎn)生的類黑精也會(huì)有助于豆豉的抗氧化能力提升[26]，而乙醇、食鹽的添加會(huì)降低豆豉的抗氧化活性等[17-18]。

3 結(jié)論與分析

本研究探索了不同類型豆豉的抗氧化活性及其影響因素，研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)菌型pH在7左右，明顯高于霉型豆豉；細(xì)菌型水溶性蛋白含量明顯高于霉型豆豉，水解度亦有類似趨勢，說明細(xì)菌型豆豉的蛋白質(zhì)水解程度較霉型豆豉深。此外，霉型豆豉的抗氧化活性普遍高于細(xì)菌型納豆，其中以M-HY的總抗氧化能力最高，為(0.6±0.08) mmol/L，A-DXY的·OH清除率最大，為(65.3±0.62)%，細(xì)菌型豆豉的苷元型大豆異黃酮和總多酚含量均低于其他豆豉，其中B-H最低(453.7±0.81)、(22.9±0.89) mg/100 g。進(jìn)一步的相關(guān)性分析結(jié)果表明，試驗(yàn)樣品豆豉的總多酚、大豆異黃酮苷元含量分別與·OH清除率、總抗氧化能力的4個(gè)相關(guān)值均為極顯著相關(guān)，pH與·OH清除率呈負(fù)顯著相關(guān)，說明豆豉中總多酚、大豆異黃酮苷元含量的增加有助于其·OH清除活性和總抗氧化能力的增加，而pH增加會(huì)影響豆豉的抗氧化能力。