含醋酸菌粉末的食品對ICR小鼠的酒精性肝損傷的影響

陳小雪，田思敏，程永強

(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京，100083)

在全世界的社交場合都有飲酒的傳統，有報告稱少量飲酒可降低總死亡風險[1]，但過度飲酒會對身心造成不良影響和社會損失[2]。例如從心理方面來看，過度飲酒可能導致判斷力下降并做出反社會行為。另外從生理方面來看，可能導致頭痛、惡心，甚至肝損傷。初期癥狀可見因肝臟脂肪蓄積[3]、肝細胞損傷導致的谷草轉氨酶(glutamic oxaloacetylase, AST)和谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)流出釋放至血液中[4]。癥狀惡化會發展成肝炎、肝硬化、肝癌[5]，癥狀越嚴重則越難治療，因此盡早采取治療對策尤為重要。

過量飲酒導致的這些現象是由于乙醇及其代謝物乙醛引起的。攝入的乙醇主要在肝臟中通過乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)和乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, ALDH)途徑被代謝[6]，當攝入的乙醇量超出體內ADH和ALDH活性容許量時，乙醇和乙醛就會滯留在體內，對機體產生各種影響[7]。其中乙醛具有強毒性，被國際癌癥研究機構確認為Ⅰ類致癌物，會通過氧化應激形成脂質、蛋白質加成物，對肝臟細胞造成損傷[8]。ADH和ALDH的活性因人而異，亞洲人與其他人種相比，低活性型即“酒量差”的人較多[9]。

醋是自古以來餐桌上常用的調味料，除了具有調味功能之外，還有抑制血壓升高和促進鈣吸收等保健功能[10-11]，部分醋(山西老陳醋、柿子醋等)具有高抗氧化功能，可減輕酒精性肝損傷[12-13]。正如醋的英文單詞“vinegar”來源于“酸紅酒”的含義，醋是醋酸菌利用酒精發酵制成的。醋酸發酵過程與酒精在人體中代謝的過程類似，是由醋酸菌利用其ADH和ALDH進行的[14]。

我們關注到醋的制造工藝與乙醇在人體肝臟中代謝的類似性，提出了以下假設，即按照醋的制造工藝，精制出具有ADH和ALDH活性的組分，將其與乙醇同時攝入，或許乙醇能夠在體內被代謝成為醋酸，以減輕乙醇和乙醛的毒性。在此之前，已有相關研究闡明具有ADH和ALDH活性的醋酸菌粉末(acetic acid bacterial powder)與乙醇同時攝入可降低人體呼氣和血液中的乙醇濃度[15]。此外，在對小鼠的經口喂食試驗中，凍干醋粉末減輕了因亞急性酒精攝入導致的肝損傷和急性酒精攝入導致的肝臟脂肪蓄積[16]。在本研究中，給小鼠喂食項目組開發的含醋酸菌粉末的營養輔助食品(acetic acid bacterial powder-containing food, AF)，并研究其對酒精急性攝入導致肝損傷的減輕作用。

1 材料和方法

1.1 樣品

供試樣品為AF膠囊內容物(日本丘比株式會社提供)，保存條件：4 ℃冷藏保存。

1.2 實驗動物

選用北京維通利華實驗動物技術有限公司(SCXK(京)2016—0006)提供的無特定病原體(specified pathogen free, SPF)級雄性美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research, ICR)小鼠，共50只，體質16～18 g，適應環境3～5 d后，進行實驗。按體質進行隨機分組，每組10只。所有動物實驗均以實驗動物飼養和儲存以及疼痛緩解標準為基礎，經CAIQtest動物研究委員會審核批準。

1.3 主要儀器與試劑

Synergy HIM多功能酶標儀,美國伯騰儀器有限公司; TBA-120FR全自動生化分析儀,東芝;PK-0200S勻漿器,美國PRO;CRYOSTAR NX50冰凍切片機,Thermo。

丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒(南京建成，批號：20190326); 還原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)測定試劑盒(南京建成，批號：20190220); 總蛋白(total protein, TP)測定試劑盒(南京建成，批號：20190119);甘油三酸酯(triglyceride, TG)測定試劑盒(中生北控，批號：181001); AST測定試劑盒(中生北控，批號：180791);谷草轉氨酶(glutamic oxaloacetylase, ALT)測定試劑盒(中生北控，批號：190851); 葡萄糖(glucose, GLU)測定試劑盒(中生北控，批號：180831);膽固醇(cholesterol, CHO)測定試劑盒(中生北控，批號：181641)。

1.4 劑量選擇與受試物給予方式

設0.033、0.067、0.200 g/kg AF膠囊內容物，同時設模型對照組和空白對照組。稱取0.33、0.67、2.00 g AF膠囊內容物，分別用植物油定容至10 mL，即為低、中、高劑量組，臨用前配制，模型對照組和空白對照組給予植物油，各劑量組均按0.01 mL/(10 g BW)給予灌胃。

1.5 實驗方法

參考文獻[17]并改進了乙醇給予的方法。指標測定前一天，稱量小鼠體質量，空白對照組直接給予植物油(0.01 mL/10 g)；模型對照組1次灌胃給予植物油(0.01 mL/10 g)和體積分數50%乙醇(0.48 mL/40 g)；劑量組1次灌胃給予不同劑量的受試樣品(0.01 mL/10 g)和體積分數50%乙醇(0.48 mL/40 g)。禁食不禁水16 h，拔眼球采血1.0～1.2 mL，3 500 r/min離心10 min，收集血清，血生化儀測定AST、ALT和GLU。解剖取肝臟稱重，計算肝臟質量與體積比，取肝右葉0.5 g，按質量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿制成10%(質量分數)肝勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液待測，參照試劑盒說明書測定肝勻漿MDA、GSH含量，使用血生化儀測定肝勻漿TG及CHO含量。

從肝左葉中部做橫切面取材，冰凍切片后，油紅O染色[18]，從肝臟的一端視野開始記錄細胞的病理變化，用40倍物鏡連續觀察整個組織切片。主要觀察脂滴在肝臟的分布、范圍和面積。具體評分標準如表1所示。

表1 評分標準

2 結果與分析

2.1 小鼠體重水平

由表2可知，經統計學分析，小鼠體質量在各劑量組與模型對照組間比較，均無顯著性差異(P>0.05)。

表2 小鼠體質量情況

2.2 AF對小鼠肝臟MDA、GSH、TG及CHO水平的影響

由表3、表4可知，經統計學分析，模型對照組與空白對照組比較，肝臟MDA、TG、CHO水平升高，GSH水平降低，可判定造模成功。給予受試物后，高劑量組的GSH水平高于模型對照組，差異具有顯著性(P<0.05)；中、高劑量組的TG水平低于模型對照組，差異均具有顯著性(P<0.05)；中劑量組CHO水平低于模型對照組，差異均具有顯著性(P<0.05)；其MDA水平在各劑量組與模型對照組間比較，差異均無顯著性(P>0.05)。

表4 AF對小鼠肝臟TG及CHO水平的影響

表3 AF對小鼠肝臟MDA及GSH水平的影響

2.3 AF對小鼠血清AST、ALT、GLU水平的影響

由表5可知，經統計學分析，模型對照組與空白對照組比較，血清AST、ALT、GLU水平升高，可判定造模成功。給予受試物后，高劑量組的ALT水平低于模型對照組，差異具有顯著性(P<0.05)；低、高劑量組的GLU水平低于模型對照組，差異均具有顯著性(P<0.01)；各劑量組AST水平與模型對照組比較，差異均無顯著性(P>0.05)。

表5 AF對小鼠血清AST、ALT及GLU水平的影響

2.4 病理組織學檢查結果

由圖1及表6可知，經統計學分析，模型組病理評分高于空白對照組，可判定造模成功。空白對照組小鼠肝小葉結構相對較完整，脂肪變性程度較輕；而模型組小鼠肝小葉結構破壞，脂肪變性明顯；高劑量組小鼠肝臟脂肪變性程度較模型組明顯減輕，高劑量組病理評分低于模型組，差異具有顯著性(P<0.05)。

圖1 肝臟脂質積累組織學的分析(40倍物鏡)

表6 AF對小鼠肝臟病理組織學檢查結果的影響

3 討論與結論

為了將功能性成分制成便于攝入的形態，在含醋酸菌粉末作為主要原料的基礎上，添加了賦形劑、分散劑等各類成分。因此，與攝入功能性成分單體相比，作為復合形態的AF功能表現可能有所不同。本課題組曾報告醋酸菌粉末對因攝入酒精導致的肝臟脂肪蓄積具有減輕作用[16]，而在本研究中，使用醋酸菌粉末作為原料制造的AF也具有同樣效果。此外，AF對因攝入酒精導致的ALT水平升高也有抑制作用。由此可知，AF可用作減輕肝損傷的營養輔助食品。

AST和ALT會由于肝臟細胞受到損傷而流出至血液中，從而成為臨床上使用的肝功能指標。朱詩雅等[19]利用這2個指標評價了不同乳桿菌對慢性酒精性肝損傷的緩解作用。但AST與ALT器官特異性不同，ALT幾乎只單獨存在于肝臟，而AST除了存在于肝臟之外，還廣泛存在于心肌、骨骼肌、紅細胞等組織[20]。在本研究中，AF對因攝入乙醇導致的ALT升高有減輕作用，而對AST水平升高無影響。由此可知，AF通過肝臟來發揮特異作用。

在本研究中，攝入酒精除了導致肝臟脂肪蓄積之外，還可見血糖值升高。脂質代謝和糖代謝具有相互影響的作用[21]。AF通過減輕因攝入酒精導致的肝臟脂肪蓄積，因此還可能會同時減輕血糖值的升高。但是，AF對血糖值的影響與濃度無相關性，因此推測除了AF的減輕脂肪蓄積作用之外，還有其他因素的影響。

肝臟中的膽固醇通過合成與分解、排泄的平衡來維持穩定[22]。有研究表明，在大鼠試驗中，喂食酒精4周會導致膽固醇代謝異常[23]。在本研究中，可見急性攝入乙醇導致肝臟膽固醇量增加，由此可知，單次攝入乙醇也會對肝臟的膽固醇代謝造成影響。本研究結果顯示AF對肝臟膽固醇蓄積的減輕作用與濃度無相關性，其詳細機制還有待于進一步研究。

綜上所述， AF對急性酒精性肝損傷小鼠具有一定肝臟保護作用，可減輕因乙醇導致的肝損傷。