陶融型大曲培養貯存過程生化指標變化規律及相關性研究

陳蒙恩，韓素娜，侯建光，李建民，陳偉平，李華，鄧杰，胡曉龍

1(河南仰韶酒業有限公司，河南 三門峽，472400) 2(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢，643000) 3(鄭州輕工業大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州，450002)

大曲是一種富含微生物菌群、菌系及復合曲香的微生態制品，具有糖化、發酵、生香等功能，是中國曲酒的主要糖化發酵劑和生香劑，其質量優劣會對白酒釀造過程中的出酒率、酒質、風格等造成直接影響[1-3]。優質大曲曲香味突出，功能微生物數量能達到曲酒工藝生產所需的數量級，且具有適宜的理化指標。目前，對大曲的研究多趨向于某些特定指標，如感官指標、理化指標以及微生物指標等[4]，而對微生物與相關指標間的相關性以及如何在制曲工藝中全面提升大曲品質的研究較少。

陶融型大曲是在仰韶地區自然環境、生產原料、釀造工藝等因素的前提下，以小麥、大麥、豌豆為原料，經自然接種、陶屋培養發酵而成的陶融型白酒專用大曲[5]。大曲中所富含的細菌、霉菌、酵母菌等是釀造陶融型白酒不可缺少的微生物資源，這些微生物能夠利用原料中的淀粉、蛋白質等營養物質進行繁殖代謝，分泌陶融型白酒釀造過程中所需的糖化酶、淀粉酶等各種酶系。釀酒原料中的淀粉等大分子物質在生物酶和特定條件下，經過一系列復雜的生化反應而產生種類眾多的芳香類物質，這些芳香類物質對大曲酒特有香味成分起著重要貢獻作用[6-7]。本研究以陶融型白酒釀造專用大曲為樣本，對不同階段的大曲微生物指標及理化指標進行系統分析[8-9]，對大曲不同生化指標間的相關性進行研究，為制定陶融型大曲的質量標準，改良制曲工藝，提高優質曲率提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 樣品

樣品取自河南仰韶酒業有限公司制曲車間。

1.1.2 主要試劑

HCl、甲醛，洛陽昊華化學試劑有限公司；KH2PO4，成都市科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉，天津市光復科技發展有限公司；NaOH、MgSO4·7H2O、Na2HPO4、無水乙醇、葡萄糖，天津市凱通化學試劑有限公司。以上各試劑均為分析純。干酪素(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基的配制

細菌培養基(g/L)：葡萄糖15，胰蛋白胨5，牛肉膏5，NaCl 5，納他霉素1，瓊脂粉12，pH 7.0；酵母培養基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，豆芽200，氨芐青霉素1，瓊脂粉12，pH 6.0；霉菌培養基(g/L)：去皮馬鈴薯200，葡萄糖20，蛋白胨0.5，KH2PO45，MgSO4·7H2O 3，VB10.1，瓊脂粉12，氨芐青霉素1，pH 7.0。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-VS2型超凈工作臺，無錫易純凈化設備有限公司；DHP 9272型電熱恒溫培養箱、MJ-Ⅱ型霉菌培養箱、DHG-9123A型鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；HYG-B型全溫搖瓶柜，蘇州培英實驗設備有限公司；LPZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠； HH-4型數顯恒溫水浴鍋，金壇市晶玻實驗儀器廠；UV-1800型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣方法

選取河南仰韶酒業有限公司夏季同時入房的5房曲，安曲后在第1、3、5、7、9、15、30天取樣，大曲培養時間為30 d，將成品大曲放置于通風、干燥、常溫環境中貯存，同時對貯存期60、90、120 d的5房曲進行跟蹤取樣。每房大曲所選樣品事先用紅布條進行標記，在大曲翻曲、并房、打攏、貯存階段仍將其放入指定位置，以便樣品能代表整房曲；每房曲均采用四點中心法進行取樣，樣品粉碎后過40目篩，四分法濃縮至150 g，裝于無菌袋內，4 ℃貯存備用。大曲培養過程和貯存過程溫度的采集：將溫度計事先插入成型后大曲的曲心處，采用四點中心法測量大曲溫度。

1.3.2 水分、酸度測定

水分、酸度的測定方法參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[10-11]。水分含量及酸度分別按公式(1)、(2)計算：

(1)

式中：X，含水質量分數，g/100 g；m1，烘干前稱量瓶加試樣的質量，g；m2，烘干后稱量瓶加試樣的質量，g；m，稱量瓶的質量，g。

(2)

式中：Y，酸度，mmol/10 g；c，NaOH標準溶液的濃度，mo1/L；V1，滴定試樣時，消耗NaOH標準溶液的體積，mL；V0，空白試驗時，消耗NaOH標準溶液的體積，mL；200，試樣稀釋體積，mL；20，取樣液進行滴定的體積，mL。

1.3.3 氨態氮、還原糖、淀粉含量測定

通過NaOH滴定法對氨態氮含量進行測定[12-13]；通過3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)比色法對大曲中還原糖含量進行測定[14-15]；采用體積比1∶4的 HCl 進行加熱回流水解，用斐林試劑測定生成的糖[16]。

1.3.4 糖化力、液化力測定

采用DNS法對大曲糖化力進行測定，糖化酶活力定義：1 g大曲在35 ℃、pH 4.6條件下，1 h水解淀粉生成1 mg葡萄糖為1個糖化力單位，以U/g表示[16]。參照QB/T 4257—2011對大曲液化力進行測定，液化酶活力定義：1 g大曲在35 ℃、pH 4.6條件下1 h能液化淀粉1g為1個液化力單位，以U/g表示[17-18]。

1.3.5 發酵力、酯化力測定

發酵力以1 g曲樣在25 ℃糖化液中發酵48 h失去的質量(U/g)計算[19]；酯化力以1 g絕干曲在30 ℃條件下反應72 h催化己酸和乙醇合成己酸乙酯質量計算(U/g)[14]。

1.3.6 蛋白酶活力測定

蛋白酶酶活力測定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[20]。酶活定義：1 g大曲在40 ℃，pH 3.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1個酸性蛋白酶活力單位，以U/g表示；1 g大曲在40 ℃，pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1個中性蛋白酶活力單位，以U/g表示。

1.3.7 大曲微生物含量檢測

采用傳統平板計數法對不同大曲樣品的細菌、霉菌、酵母、芽孢的含量進行測定。稱粉碎后的樣品1 g溶于99 mL無菌生理鹽水中，搖床振蕩30 min使曲粉充分振蕩均勻。采用梯度稀釋法，將預培養樣品分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，吸取10-5梯度樣品200 μL涂布于霉菌培養基，30 ℃恒溫培養2～4 d后計數[25]；分別吸取10-7梯度樣品200 μL涂布于酵母和細菌培養基，酵母培養基置于28 ℃恒溫培養2～4 d后計數[24-25]，細菌培養基置于37 ℃恒溫培養1～2 d后計數[21-22]；芽孢桿菌要先在80 ℃水浴30 min，對非芽孢桿菌進行預處理，再選擇牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基在37 ℃下培養1～2 d后計數[23]。

1.3.8 理化指標與微生物指標相關性分析[9,26]

數據采用SPSS 19.0軟件和Origin 9.0進行統計分析、繪圖和相關性分析，顯著性水平設定在5%。

2 結果與分析

2.1 理化指標分析結果

對大曲培養及貯存過程中溫度、水分等理化指標進行測定，結果見圖1～圖2。隨著安曲時間的增長，氨態氮、酯化力呈上升趨勢，且隨著時間的增長其上升幅度逐漸減小；糖化力、發酵力、蛋白酶活力呈先增后降趨勢，最后又略微上升直至恒定狀態；水分、淀粉含量隨時間的增長呈遞減趨勢，且遞減幅度逐漸減小；酸度呈先升后降趨勢。這主要是因為隨著發酵時間的增長，微生物數量快速增長，致使氨態氮等指標呈上升趨勢，隨著微生物繁殖代謝的持續進行，大曲溫度急劇上升，低溫微生物大量死亡，糖化力等指標快速下降；隨后一些耐熱芽孢桿菌大量繁殖，造成酸度等指標的波動性變化。

圖1 發酵時間與溫度的關系

由圖2可知，大曲培養結束出房時(30 d),酸度在0.3～1.5 mmol/10 g，水分含量<14%，貯存至120 d時糖化力仍在700 U/g以上，滿足我國輕工行業標準QB/T 4259—2011對優質大曲理化指標的要求。大曲的糖化力與溫度變化成一定的負相關性，在曲溫較低時酶活力較高，說明大曲中淀粉酶主要靠低溫微生物產生，這與傳統研究結果相一致。蛋白酶活力呈先增后降再增趨勢，這與大曲培養過程中品溫變化有關。溫度過高使已形成的蛋白酶失活，在后期品溫降低過程中，部分產蛋白酶的微生物再次復活，致使最終蛋白酶活力達到一定高度。在120 d時，大曲蛋白酶活力仍保持在35 U/g左右，滿足優質大曲標準。蛋白酶能通過美拉德反應，將大分子物質轉換為曲香形成的前體物質[27]，因此，蛋白酶活力的高低往往決定了大曲風味物質的含量。

圖2 時間與理化指標的關系

2.2 大曲培養及貯存過程微生物指標變化

采用平板分離法對大曲微生物進行研究，結果見圖3和圖4。入房前3 d，細菌、霉菌、酵母、芽孢數量都急劇增加,隨著發酵時間增長、曲溫升高，低溫微生物數量下降,曲溫升至50 ℃左右時，大部分真菌已死亡，耐高溫芽孢桿菌大量繁殖。細菌數量在5 d時處于最大值，可能此時品溫最適合高溫細菌生長；5 d后細菌數量開始下降，可能是由于溫度過高，一些芽孢桿菌開始進入芽孢休眠狀態。大曲培養過程中酵母菌數量一直變化不大，可能是由于大曲入房溫度過高，且培養過程中升溫過快，超過了酵母菌生長繁殖的最佳溫度所致。成品大曲入庫后，由于大曲水分較低，無法滿足微生物生長代謝對水分的需求，致使各種微生物含量基本處于恒定狀態。從整個大曲微生物區系分析，在培菌期(0～10 d)，大曲微生物以細菌和霉菌為主；培菌期后以耐熱芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌和芽孢為主；成品大曲中，細菌、霉菌、芽孢含量相差不大，酵母含量較低。

圖3和圖4結果表明，在大曲培養初期(0～7d)酵母含量略有上升，之后迅速下降至培養初期數量，120 d時其含量在1.9×105CFU/g左右。大曲中的有益霉菌，如曲霉、根霉，在發酵過程中產生多種復合酶類，在白酒釀造過程中主要起糖化水解作用。霉菌數量在培菌后期雖然有下降，但在大曲中仍占一定比例，在貯存至120 d時其含量在1.6×105CFU/g左右，這也是成品大曲糖化力最終保持在700 U/g以上的原因。細菌是白酒釀造微生物的重要組成部分，芽孢桿菌在一定程度上對白酒的風味和質量起關鍵作用。大曲在培養至第10天時，芽孢數量有所下降，可能是因為第10天翻曲，曲房及大曲品溫下降，致使部分芽孢從休眠中復蘇所致。在大曲貯存至120 d時，細菌含量保持在1.4×107CFU/g左右，芽孢含量在5.6×107CFU/g左右，芽孢含量仍處于較高數量級，可滿足生產優質白酒所需。

圖3 時間與微生物指標的關系

圖4 大曲培養及貯存過程不同類型微生物數量占比

2.3 相關性分析

大曲發酵和貯存過程中，其生化指標之間存在一定的相關性。如表1所示，酸度與細菌數量、糖化力與霉菌數量、發酵力與酵母數量、蛋白酶活力與酯化力、還原糖與水分含量、水分含量與淀粉含量等指標之間呈顯著正相關性，水分含量與時間、淀粉含量與時間、水分含量與氨態氮、液化力與還原糖、氨態氮與淀粉含量等指標之間呈顯著負相關性，這與楊勇等[9]對中高溫大曲指標的研究結果一致。表1結果表明，隨著發酵的進行，大曲中淀粉含量逐漸被消耗，水分含量逐漸降低；發酵初期糖化力和發酵力呈快速上升趨勢，這與霉菌和酵母數量的變化呈一致性，說明此時的曲溫處在霉菌及酵母菌最佳的生長范圍內；隨著曲溫的進一步升高，霉菌和酵母數量的增殖受到影響，致使糖化力和發酵力總體呈下降趨勢，說明發酵力主要由酵母提供，糖化力主要霉菌提供，這與王世寬等[28]的研究結果一致；酯化力和酸性蛋白酶活力顯著正相關，說明大曲中相關微生物新陳代謝所產生的有機酸促進了蛋白酶的合成[29]，同時，有機酸的產生也為后續的酯化反應提供了前體物質。

表1 大曲生化指標的相關性

3 結論

本文以陶融型大曲為研究對象，對其培養及貯存過程中生化指標變化規律及相關性進行深入分析，結果表明，陶融型大曲生化指標在其培養及貯存過程中呈現一定的規律性，且不同指標之間具有一定的相關性。在發酵初期(0～7 d)，酵母、霉菌、細菌大量繁殖，發酵力、糖化力、蛋白酶活力、酸度等指標急劇上升，水分、淀粉含量則快速下降；發酵中期(8～15 d)，霉菌、酵母數量速降，一些耐熱的芽孢桿菌占據優勢，糖化力、發酵力等指標急速下降，酸度持續上升，且酸度、蛋白酶活力在發酵中期達到峰值；發酵末期(16～30 d)，大曲中微生物以細菌、芽孢桿菌占主導地位，酸度、淀粉含量、酯化力、蛋白酶活力等指標下降至穩定狀態。貯存至120 d時，大曲糖化力保持在700 U/g以上，液化力在0.8 U/g左右，發酵力在0.8 U/g左右，蛋白酶活力在40 U/g以上，酯化力在20 U/g以上，細菌數量在1.4×107CFU/g左右，酵母數量在1.9×105CFU/g左右，霉菌數量在1.6×105CFU/g左右，芽孢數量在5.6×107CFU/g左右。相關性分析結果表明，酸度與細菌數量、糖化力與霉菌數量、發酵力與酵母數量、蛋白酶活力與酯化力、還原糖與水分含量、水分含量與淀粉含量等指標之間呈顯著正相關性，水分含量與時間、淀粉含量與時間、水分含量與氨態氮、液化力與還原糖、氨態氮與淀粉含量等指標之間呈顯著負相關性。

陶融型白酒在生產中采用陳曲釀酒，大曲貯存時間為3～6個月。隨著貯存期的增加，雖然大曲的一些生化指標會有所下降，但貯存期的延長，卻使得大曲曲香更加濃郁，釀出的酒質也更加柔和。本文雖然對陶融型大曲相關指標進行了多方位多因素研究，但大曲微生物群落及其多酶體系的演變機理尚不清楚，后續將通過現代分子生物學與代謝組學相結合，對陶融型大曲生化功能的形成進行解析，為改良制曲工藝及指導后期釀酒提供理論參考。