羅非魚加工副產物速釀魚露發酵過程中呈味物質分析

邊昊，陳柏宇，杜金晶，陳志炎，李銳

1(安徽工商職業學院,安徽 合肥，231131) 2(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東 湛江，524088) 3(揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇 揚州，225127) 4(嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江，524048)

羅非魚(tilapia)，又名非洲鯽魚、福壽魚等，具有生長快、抗病強、產量高等特點，是我國主要養殖經濟魚類之一[1]。據《2019年中國漁業統計年鑒》，2018年我國羅非魚產量達162.45萬t，而加工過程中副產物約38.23萬t[2]。羅非魚加工副產物包括魚頭、魚皮、內臟和魚骨等，約占整魚體重48%～57%[3-4]。研究發現，羅非魚加工副產物中粗蛋白含量約為14.4%～17.6%，同時含有豐富的礦物質以及ω-6、ω-3系列不飽和脂肪酸，具有較高的開發利用價值[5]。由于缺少有效的加工方法，這些副產物通常被丟棄，僅有小部分加工成飼料，這不僅浪費了蛋白資源，還對周圍環境造成嚴重污染[6]。如何高值化地利用羅非魚加工副產物中的蛋白，已成為近些年來研究的一個熱點。

魚露，又叫魚醬油，是一種風味獨特的傳統水產調味料，滋味鮮美、營養豐富，深受國內外消費者的喜愛[7]。傳統的魚露以低價值的魚蝦(鯷魚、毛蝦、沙丁魚等)或水產下腳料為原料，經過鹽漬、發酵、熬煉等工序，一般需要1～3年方能制得，過長的發酵時間限制其規模化生產[8-9]。針對傳統發酵法的弊端，魚露速釀工藝逐漸成為魚露生產技術的研究熱點。李銳等[10]以沙丁魚為原料，采用酶解、加曲和保溫的方法生產魚露，大大縮短了發酵時間，所得產品滋味醇厚，能達到商品要求。周敏等[11]以淡水魚加工副產物為原料，采用分段加鹽法和添加醬油酵母的方法制備速釀低鹽魚露，大大縮短了發酵周期，其產品達到了國家一級魚露標準。目前國內外關于速釀魚露的研究多集中在工藝優化，而關于發酵過程中滋味物質變化的研究鮮有報道。

魚露產品的風味與發酵過程中滋味成分的變化密切相關[12]。另有研究發現，有機酸、呈味核苷酸、游離氨基酸、無機離子等滋味物質的含量與發酵過程存在一定的相關性[10,13]。目前快速發酵法生產的魚露，總體風味上與傳統發酵魚露尚有一定差距，同時存在產品質量不穩定、生產過程中缺少科學控制標準等問題。本研究以羅非魚加工副產物為原料，采用加曲、加酶的方法制備速釀魚露，并對發酵過程中氨基態氮、可溶性總氮、無機離子、游離氨基酸、有機酸和呈味核苷酸的含量進行分析，探討發酵各階段呈味成分的變化規律，以期為魚露的生產工藝優化、產品質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚下腳料，由福建海聯進出口貿易有限公司提供，包括魚頭、內臟(除去膽囊)、魚皮、魚骨和魚尾，平板凍結后于-10 ℃冷鏈運輸到實驗室，并于-20 ℃冷凍保存；其基本營養成分為：水分含量(76.49±1.37)%，粗蛋白含量(10.55±0.54)%，粗脂肪含量(9.68±0.37)%，灰分含量(5.89±0.17)%。

醬油曲精(米曲霉，滬釀3.042)，山東康源生物科技有限公司；復合蛋白酶，湖南奧馳生物科技有限公司；PDA 培養基，青島捷世康生物科技有限公司；ADP、HxR、Hx、GMP、AMP、ATP、IMP標準品，上海源葉生物科技有限公司；有機酸和氨基酸標準品，美國Sigma公司；乙腈、甲醇(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

JMS-110型渦流式膠體磨，河北廊坊匯通機械廠；L-P1200型粉碎機，鄭州力威設備有限公司；835-50型氨基酸自動分析儀，日本Hitachi公司；LDZX-5OKBS 型立式蒸汽滅菌鍋，上海深諳醫療器械廠；Aglient 6410 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；BSC-250型恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司；PHS-3C 型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司；H-2050R型冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 醬油曲制備

參照FENG等[14]的方法，稍作改動。將醬油曲接種于PDA培養基上，置于30 ℃恒溫培養箱靜置培養2 d，挑選長勢良好的菌落，接入斜面培養基，置于30 ℃恒溫培養箱繼續培養，待斜面長滿黃綠色孢子，儲存于4 ℃冰箱備用。取50 g麩皮和60 mL蒸餾水加入到250 mL三角培養瓶中，于121℃滅菌20 min，冷卻后接入菌種，置于30 ℃的恒溫培養箱中培養60 h，每隔20～24 h輕輕搖晃培養瓶使培養基翻動均勻，待黃綠色顆粒長滿培養基時，種曲成熟。

1.2.2 速釀魚露制備工藝

工藝流程：羅非魚下腳料→解凍清洗→切塊粉碎→加水均質→加食鹽→加復合蛋白酶和醬油曲→恒溫發酵→過濾→滅菌→成品。

參照李銳等[10]的方法，稍作改動。羅非魚下腳料解凍、清洗，切塊后粉碎為肉糜，按照魚質量25%的比例加入蒸餾水，然后使用膠體磨均質，然后以混合物料重7%的比例加入食鹽，混合均勻后于10 ℃靜置2 h，加入醬油曲[m(醬油曲)∶m(混合物料)=0.004]和復合蛋白酶[m(酶)∶m(混合物料)=0.002]，混合均勻后置于35 ℃恒溫培養箱，每隔3 d攪拌1次，直至發酵完成。發酵0、1、2、3、4、5、6、7、8周時取樣，取樣前將魚露發酵液攪拌均勻，用200目紗布過濾，濾液于90 ℃水浴15 min，然后用定性濾紙過濾后用于理化指標分析。

1.2.3 其他理化指標的測定

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 可溶性總氮和氨基態氮含量的變化

可溶性總氮和氨基態氮含量是評價魚露產品質量的重要參考標準[18-19]。如圖1所示，可溶性總氮和氨基態氮含量在整個發酵過程中均呈先升高后降低的變化趨勢。發酵時間為0～3周時，魚露中可溶性總氮的含量迅速上升，于第3周達到最大值，為1.82 g/100 g，隨后逐漸下降；而氨基態氮含量在發酵時間為0～3周時增加速度較快，3～5周增加速率減緩，于第5周達到最大值,為1.46 g/100 g，隨后逐漸下降。這一結果與周敏等[11]的試驗結果相一致。

圖1 魚露發酵過程中可溶性總氮和氨基態氮含量的變化

根據前人的報道，魚露在發酵初期，蛋白在內源酶和微生物的作用下被充分降解，生成氨基酸、肽類等物質，可溶性氮和氨基態氮含量迅速增加[20]。相比可溶性總氮,氨基態氮含量達到最大值的時間延遲2周，這可能是由于隨著發酵的進行，蛋白酶活力會逐漸降低，魚肉蛋白降解會逐漸趨于平衡。在發酵第3周蛋白的降解產物中含有一定量的可溶性多肽、小分子蛋白等，在內源酶和微生物的作用下，被繼續分解為氨基酸，使得氨基態氮含量持續增加[21]。發酵后期，部分氨基酸易與羰基化合物發生美拉德反應而被消耗，同時在一部分腐敗微生物的作用下，部分蛋白氮會轉化為揮發性鹽基氮和生物胺等物質[8]。發酵結束，可溶性總氮與氨基態氮含量分別為1.59和1.24 g/100 g，根據魚露的商業標準SB/T 10324—1999，兩者都超過國家一級魚露的標準。李銳等[10]以遠東擬沙丁魚為原料，通過傳統發酵法制備魚露，可溶性總氮與氨基態氮含量分別為2.98和0.94 g/100 g。據報道，發酵液中蛋白的降解程度與發酵時間呈正相關[22]。速釀魚露由于發酵時間不足，可溶性總氮含量要低于傳統魚露，但傳統魚露在發酵后期，部分氨基酸會被不斷消耗，因此氨基態氮含量會低于速釀魚露。

2.2 無機離子含量的變化

表1 魚露發酵過程中無機離子含量的變化 單位：mg/100 g

2.3 游離氨基酸含量的變化

游離氨基酸與魚露滋味形成密切相關[23]。速釀魚露發酵過程中游離氨基酸含量的變化如表2所示，速釀魚露未發酵時游離氨基酸總量為979.01 mg/100 g，鮮甜味氨基酸含量為186.8 mg/100 g，占總量的19.08%。魚露中鮮甜味氨基酸含量在發酵第0～5周快速增加，與發酵時間呈正相關性，并于發酵第5周達到最大值，為4 692.16 mg/100 g，占總量的39.24%；在發酵第6～8周鮮甜味氨基酸含量逐漸下降，與發酵時間呈負相關，這與氨基態氮含量的分析結果相一致。李銳等[10]報道了傳統發酵魚露中游離氨基酸總量為10 869.51 mg/100 g，其中鮮甜味氨基酸占比為48.2%。據報道，魚露中氨基酸的代謝過程與發酵過程中微生物活動密切相關，氨基酸含量會隨著發酵時間延長而增加[24]。傳統魚露經過長時間發酵能積累較多的鮮甜味氨基酸，而速釀魚露通過添加醬油曲和蛋白酶的方法雖然能加速蛋白的水解，但同時產生較多的苦味氨基酸，鮮甜味氨基酸比例要低于傳統魚露。速釀魚露在風味上稍劣于傳統魚露，其優點在于降低了產品鹽度，同時縮短了生產周期，便于工業化生產。

表2 魚露發酵過程中游離氨基酸含量的變化 單位：mg/100 g

續表2

在鮮味氨基酸中，天門冬氨酸和谷氨酸的含量在發酵第0～7周時迅速增加，分別于發酵第6周和第7周達到最大值(1 240.51和1 398.84 mg/100 g)，隨后含量稍有下降；而在甜味氨基酸中，甘氨酸和丙氨酸均在發酵第5周達到最大值(973.60和1 146.15 mg/100 g)，隨后逐漸下降。速釀魚露在發酵后期苦味氨基酸含量大幅度增加，特別是賴氨酸和精氨酸，與未發酵時相比，其含量在發酵第8周分別增加14.27和17.75倍。精氨酸在較低濃度時呈現清爽的鮮味，與其他鮮甜味氨基酸協調能增加產品的醇厚感和風味層次，而在高濃度時產生苦味，使產品風味變差[24]。ZHAO等[25]報道了魚露中耐鹽微生物的次級代謝產物中存在核苷酸、氨基酸、糖類等極性物質，而過長的發酵時間可能會使苦味氨基酸大量積累，使產品風味劣化。游離氨基酸含量的變化主要是由于在發酵初期魚肉蛋白被不斷水解，使游離氨基酸含量快速增加；隨著發酵時間的延長，微生物的代謝活動會產生新的氨基酸，同時部分氨基酸轉化為生物胺和揮發性鹽基氮等物質，非酶促褐變反應也會不斷地消耗氨基酸，這使得氨基酸含量發生變化[26]。

2.4 有機酸含量的變化

如表3所示，魚露在未發酵時有機酸中含量最高的是乙酸(257.88 mg/100 g)，其次為琥珀酸(212.05 mg/100 g)，含量最低為蘋果酸(35.63 mg/100 g)。速釀魚露中有機酸總量由未發酵時的758.01 mg/100 g，于第8周增加到2 326.20 mg/100 g，含量增加了2.07倍，這說明速釀魚露在發酵過程中有大量有機酸生成。蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸的含量隨發酵時間延長均逐步增加，且與發酵時間呈正相關性。其中乙酸含量增速最快，由未發酵時257.88 mg/100 g，增加到第8周的1 150.67 mg/100 g，含量增加了3.46倍。琥珀酸含量從212.05 mg/100 g(發酵第0周)增加到652.19 mg/100 g(發酵第8周)，含量增加了2.18倍；而乳酸在發酵0～4周時，其含量緩慢增加，從第5周開始迅速增加，從未發酵時198.24 mg/100 g增加到發酵第8周的384.68 mg/100 g。蘋果酸和檸檬酸含量在發酵過程中增加幅度較小，與未發酵時相比，這2者在發酵第8周含量分別增加74.49%和41.1%。

表3 魚露發酵過程中有機酸含量的變化 單位：mg/100 g

乙酸是一種具有爽快酸味的有機酸，其閾值僅為12 mg/100 g，對魚露的滋味有重要貢獻[12]。乙酸主要由糖類在厭氧菌的作用下產生，由于魚肉中糖類含量很少，被厭氧菌作用的糖類可能來源于種曲中的麩皮。琥珀酸和乳酸是水產品中對呈味有重要貢獻的2種有機酸，特別是琥珀酸及其鈉鹽[27-28]。有研究指出，丙酮酸脫水還原可形成琥珀酸，另外部分氨基酸在微生物作用下脫去氨基也可形成琥珀酸。部分乳酸可能來自于魚肉本身，大多數則來自于發酵過程[12,21,25]。綜上，5種有機酸中乙酸和琥珀酸含量增加幅度大，且閾值較低，對滋味有重要貢獻，它們共同賦予速釀魚露酸味、鮮味和發酵香味。

2.5 呈味核苷酸含量的變化

呈味核苷酸影響魚露產品的口感和風味。這些核苷酸化合物中，IMP、GMP、AMP因其閾值低且鮮味突出，是重要的呈鮮物質[12,23,27]。HxR和Hx是核苷酸降解的最終產物，具有苦澀味，對整體風味有不良影響。速釀魚露發酵過程中呈味核苷酸含量變化如表4所示。魚露在未發酵時，HxR含量最高，為57.86 mg/100 g，呈鮮味的5種核苷酸(IMP、GMP、AMP、ATP和ADP)含量為111.65 mg/100 g，占總量的55.02%。在發酵過程中，AMP和Hx含量大幅度增加，其中AMP含量在發酵第0～6周快速增加，于第6周達到最大值，為169.26 mg/100 g(增加了4.05倍)，在后期有所下降，但始終處于較高水平；Hx含量變化與發酵時間呈正相關性，于發酵第8周達到最大值323.18 mg/100 g(增加了8.67倍)。GMP、IMP和HxR含量有小幅度增加，與未發酵時相比，在發酵第8周增加了88.67%、21.02%和65.64%。ATP含量在發酵第0～6周小幅度增加，自第6周后未檢出；ADP含量與發酵時間呈負相關性，在發酵第0～4周含量逐漸下降，自第4周后未檢出。

表4 魚露發酵過程中呈味核苷酸含量的變化 單位：mg/100 g

魚露發酵過程中呈味核苷酸含量變化是一個較為復雜的動態過程，受魚肉內源酶和微生物中肌苷核苷酶的共同作用[29]。ATP和ADP的化學結構不穩定，隨著發酵時間增加，兩者易轉化為其他關聯化合物，而HxR和Hx作為最終降解產物，含量逐漸增加。有研究表明，魚露中的耐鹽微生物在發酵后期，會產生氨基酸、核苷酸、甘油和糖類等極性物質，用來調節細胞滲透壓來獲取水分[30]。隨著發酵時間增加，速釀魚露中呈鮮味的AMP含量大幅度增加，但HxR和Hx大量積累，使魚露的苦味加重，風味劣化。因此速釀魚露在生產過程中需合理控制發酵時間。

2.6 呈味核苷酸與游離氨基酸的協同增鮮作用

協同增鮮作用通過EUC來評價，表示呈味核苷酸與鮮味氨基酸的結合相當于一定濃度的味精所產生的鮮味強度[23]。速釀魚露發酵過程中EUC變化如圖2所示。在發酵過程中，EUC值呈先上升后下降的變化趨勢。魚露在未發酵時鮮味氨基酸和呈味核苷酸含量較低，EUC值僅為2.07 g MSG/100 g；隨著發酵時間增加，蛋白被充分水解，產生大量的鮮味氨基酸，同時微生物的作用使得呈味核苷酸不斷積累，EUC值迅速增加，于發酵第6周達到最大值，為17.59 g MSG/100 g。由于呈味核苷酸和鮮味氨基酸含量在發酵后期呈下降趨勢，在發酵6～8周時，EUC值不斷下降至10.54 g MSG/100 g。

圖2 魚露發酵過程中味精當量的變化

3 結論