土豆燒牛肉方便菜肴脹袋微生物分離鑒定及產(chǎn)氣特性研究

李 慧，盧 玉，鐘 鳴，李小燕，張晨悅，陳文波，王乃娟，陳 輝

（1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院，營(yíng)養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102209；2.浙江舟富食品有限公司，浙江 舟山 316200）

牛肉含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及礦物質(zhì)，并且脂肪與膽固醇含量比其他肉類要低，味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高[1]。以牛肉為原料的菜肴數(shù)不勝數(shù)，其中土豆燒牛肉味道濃郁，肉菜結(jié)合，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛。因此，實(shí)現(xiàn)土豆燒牛肉方便菜肴的工業(yè)化生產(chǎn)，可滿足消費(fèi)者對(duì)這一傳統(tǒng)菜肴方便、快捷、營(yíng)養(yǎng)、衛(wèi)生的大量需求[2]。但土豆燒牛肉產(chǎn)品含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[3]，另外生產(chǎn)所用原輔料種類繁多，來源復(fù)雜。如果原輔料控制不嚴(yán)，殺菌不徹底，在適宜的貯藏條件下，殘留微生物極易大量繁殖，引起產(chǎn)品脹袋及腐敗變質(zhì)等問題，不僅影響食用的口感，更威脅人體健康，同時(shí)帶來經(jīng)濟(jì)損失。因此分析土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品脹袋微生物，為更好的確認(rèn)原輔料驗(yàn)收、殺菌等工藝參數(shù)，并保留產(chǎn)品原有色、香、味等奠定良好的基礎(chǔ)。

有關(guān)食品脹袋微生物分離鑒定的報(bào)道較多，如謝婷婷等[4]從脹袋鮑汁中分離出地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌；馮勁等[5]從變質(zhì)番茄沙司和燒烤汁中分離并鑒定了4株乳酸菌；李新楠等[6]從脹袋真空包裝鮮切藕片中分離鑒定出陰溝腸桿菌，蠟樣芽孢桿菌和酵母菌。Xu[7]等從脹罐濃縮牛奶中分離鑒定了6株嗜滲菌膜假絲酵母（Candida pelliculosa）。但是對(duì)于引起土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品脹袋的特定污染微生物研究報(bào)道較少，且不同的食品脹袋微生物應(yīng)有不同的針對(duì)性分離、鑒定和分析。

目前，微生物鑒定常用的方法有形態(tài)觀察、生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定[8-9]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜MALDI-TOF MS技術(shù)用于微生物鑒定是近幾年發(fā)展起來的一門新技術(shù)，通過檢測(cè)未知微生物的蛋白質(zhì)指紋圖譜，并與質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)中特征性譜圖進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)待測(cè)微生物進(jìn)行快速鑒定。該方法具有檢測(cè)成本低、檢測(cè)時(shí)間短、易于操作等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。嵇金如[10]等利用MALDI-TOF MS技術(shù)，有效鑒定了20株生化法無法區(qū)分的醫(yī)院不動(dòng)桿菌（Acinetobacternosocominalis）和皮特不動(dòng)桿菌（Acinetobacter pittii）。H?ll等[11]利用MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定氣調(diào)包裝禽肉腐敗微生物的動(dòng)態(tài)變化，證明該技術(shù)不僅鑒定通量高，鑒定準(zhǔn)確率也高。

本研究以脹袋土豆燒牛肉方便菜肴試制產(chǎn)品為原料，通過選擇分離得到純化微生物菌種，并將MALDI-TOF MS技術(shù)與常用的微生物鑒定方法相結(jié)合對(duì)所分離純化的微生物進(jìn)行菌種鑒定，進(jìn)一步把分離鑒定的微生物回接產(chǎn)品進(jìn)行產(chǎn)氣性能驗(yàn)證，旨在確定引起本研究產(chǎn)品脹袋的微生物種類，使得脹袋原因得到有效溯源，為方便菜肴生產(chǎn)企業(yè)采取有效控制措施，保障方便菜肴產(chǎn)品生產(chǎn)的質(zhì)量與安全，避免生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)損失提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品正常及脹袋土豆燒牛肉方便菜肴：浙江舟富食品有限公司提供的試制產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基

孟加拉紅培養(yǎng)基、麥芽浸膏（瓊脂）培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基、MRS（瓊脂）培養(yǎng)、MC瓊脂培養(yǎng)基：購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 化學(xué)試劑

細(xì)菌革蘭氏染液、細(xì)菌芽孢染液：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl分析純：北京化工廠；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒：天根生化科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）、Taq酶（5U/uL）及Buffer：寶生物工程（大連）有限公司；引物：英濰捷基上海貿(mào)易有限公司合成；質(zhì)譜樣本預(yù)處理試劑盒、標(biāo)本板：Autobio安圖生物工程股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

拍擊式均質(zhì)器400 VW：法國(guó)Interscience公司；IPP260 低溫培養(yǎng)箱：德國(guó)Memmert公司；生物安全柜：新加坡ESCO；Autof MS1000基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司；Scope A1正置相差顯微鏡：德國(guó)ZEISS；Scan1200 自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀：法國(guó)Interscience公司；SQ510C立式壓力蒸汽滅菌器：日本YAMATO；Bead Beater：美國(guó)Biospec公司；Veriti梯度PCR儀：美國(guó)Lifetechnologies；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)：美國(guó)ThermoFisher公司；XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脹袋微生物菌種的分離和純化

從脹袋土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品中無菌操作稱取25 g樣品，置盛有225 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液，然后將此樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-6[12]。取各梯度稀釋樣品勻液1 mL于無菌平板中，將15～20 mL冷卻至46 ℃的孟加拉紅培養(yǎng)基、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MC瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。

孟加拉紅培養(yǎng)基平板、麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d；營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂平板、MRS培養(yǎng)基平板、MC培養(yǎng)基平板倒置于36 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別需氧和厭氧培養(yǎng)（厭氧罐）2～3 d。根據(jù)菌落形態(tài)，大小及顏色的不同，挑選不同的單菌落接種于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基中至少純化3次，最后接種試管斜面于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 形態(tài)學(xué)觀察

將保藏菌株001、002、003、004、005和006在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，36 ℃培養(yǎng)48 h，將菌株007在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線，36 ℃厭氧培養(yǎng)72 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況及菌落形態(tài)，取單個(gè)菌落1環(huán)進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，觀察菌體形態(tài)。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定

挑取培養(yǎng)平板上的單菌落分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或MRS液體培養(yǎng)，36 ℃培養(yǎng)24～72 h至OD6001.0以上。取1 mL菌液12 000 r/min離心10 min后，棄去上清，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組的說明書規(guī)定操作，所得的基因組用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度。

16S rRNA序列擴(kuò)增所用引物，正向引物為27F：5’-AGAGCCTGGCTCAGTTTGAT-3’反向引物為1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[13-14]。

PCR反應(yīng)體系：30 μL反應(yīng)體系，依次加入無酶無菌水19.2 μL、10×Buffer 3 μL、dNTPs 2.5 μL、引物各1.5 μL、Taq酶0.3 μL（5 U/μL）、所提取的基因組2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，進(jìn)入循環(huán)程序，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，4 ℃條件下暫時(shí)保存，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩CR完成后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將電泳檢測(cè)后的PCR產(chǎn)物送至英濰捷基上海貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，獲得16S rRNA基因序列。測(cè)序結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank中進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析比對(duì)，并進(jìn)行同源序列搜索，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，導(dǎo)出同源性≥99%菌株的16S rRNA基因序列區(qū)。

1.3.4 MALDI-TOF MS鑒定

微生物菌種鑒定采用Autobio公司推薦的方法，質(zhì)譜儀線性正性模式，正離子采集分子量為2 000～20 000的蛋白質(zhì)圖譜。每個(gè)樣本在不同位置擊打3次，每次40次激光點(diǎn)擊，采集得到的質(zhì)譜通過軟件進(jìn)行校正，然后與儀器內(nèi)的已知微生物數(shù)據(jù)庫(kù)圖譜進(jìn)行比對(duì)，軟件對(duì)每一組蛋白質(zhì)的質(zhì)譜比對(duì)和微生物鑒定給出相應(yīng)的分?jǐn)?shù)（0～10），最終給出鑒定結(jié)果。根據(jù)Autobio標(biāo)準(zhǔn)，分?jǐn)?shù)越高，鑒定準(zhǔn)確定的可信度越高。

1.3.5 脹袋微生物產(chǎn)氣性能驗(yàn)證

將從脹袋土豆燒牛肉方便菜肴樣品中分離純化和鑒定的菌株001～006接種肉湯培養(yǎng)基36 ℃培養(yǎng)24 h，菌株007接種MRS液體培養(yǎng)基36 ℃厭氧培養(yǎng)36 h。調(diào)整菌液濃度OD600為0.6左右備用。無脹袋現(xiàn)象土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品121 ℃滅菌30 min，無菌操作取100 g于無菌袋中并接種菌液，接種量為5%。菌株001～007接種樣品無菌袋封口后36 ℃培養(yǎng)觀察產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象，菌株007接種樣品同時(shí)置厭氧罐中36 ℃培養(yǎng)觀察產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象，以未接種的樣品為空白對(duì)照。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

使用MEGA 6.0軟件對(duì)分離微生物的16S rRNA基因序列和GenBank內(nèi)BLAST同源性比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

質(zhì)譜分析儀采集軟件為Autof Acquirer，分析軟件為Autof Analyzer，用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系統(tǒng)誤差校正。微生物屬及種判斷標(biāo)準(zhǔn)：9.5～10.0為種水平置信，可能的亞種；9.0～9.5為種水平置信；6.0～9.0為屬水平置信；0.0～6.0為不可置信。本研究選取≥6.0為待測(cè)菌株的鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株菌落及菌體形態(tài)觀察

通過對(duì)脹袋土豆燒牛肉中的微生物進(jìn)行分離、純化、簡(jiǎn)單形態(tài)學(xué)觀察后得到7株不同形態(tài)的細(xì)菌，未檢出真菌類微生物。7株細(xì)菌依次編號(hào)為001、002、003、004、005、006和007，菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 細(xì)菌的菌落及菌體形態(tài)

如圖1所示，菌株001菌落乳白色，表面粗糙不透明（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），芽孢橢圓形，中生（C）。菌株002菌落乳白色，表面粗糙不透明（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），芽孢橢圓形，中生（C）。菌株003菌落白色，菌落較小，圓形，光滑，凸起，濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊（A），菌體球狀，革蘭氏染色陽性（B）。菌株004菌落白色，菌落較小，圓形，光滑，凸起，濕潤(rùn)，不透明，邊緣整齊（A），菌體球狀，革蘭氏染色陽性（B）。菌株005菌落乳白色，表面粗糙（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），培養(yǎng)48 h，芽孢較少，芽孢橢圓形，中生（C）。菌株006菌落乳白色，表面粗糙（A），菌體桿狀，革蘭氏染色陽性（B），培養(yǎng)48 h，芽孢較少，芽孢橢圓形，中生（C）。菌株007菌落乳白色，圓形、表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊（A），菌體長(zhǎng)桿狀，革蘭氏染色陽性（B），芽孢橢圓形（C）。

壽司最傻了，比我傻多了！有一次它在玩跑輪，跑得賊快賊快，過了一會(huì)兒，可能是累了，忽然停了下來。它不知道有慣性，一下被甩了出來，前腳和后腳在空中動(dòng)來動(dòng)去，叭的一聲摔在地上，成了一塊餅！我在那里笑，沒想到我傻，它比我更傻！我以為它在跑輪里面吃了虧，會(huì)怕這個(gè)跑輪，不敢再上去了。沒想到，它直接跑到跑輪上面上廁所，上完還在上面跑。傻是不是我們倆的亮點(diǎn)？就在我想這個(gè)問題的時(shí)候，鷯哥的飯沒了，烏龜被太陽烤著，水被曬得滾燙滾燙的……

2.2 細(xì)菌16S rRNA基因序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株001～007的16S rRNA基因序列與GenBank內(nèi)已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，通過同源性比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，見圖2。

如圖2所示，菌株001、002與多株枯草芽孢桿菌/枯草芽孢桿菌亞種（Bacillus subtilis/ Bacillus subtilissubsp.subtilis）的同源性達(dá)99%以上，菌株001、002與Bacillus subtilisstrain ASB-199（MK515026.1:73-1271）在同一分枝上，且通過Bootstrap的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度，支持度達(dá)到61%（圖2a），因此可以將分離菌株001、002鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。菌株001和002聚為一枝的支持率為99%，顯示這兩株枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的親緣關(guān)系，為同一來源的菌株。

圖2 以16S rRNA基因序列為分子標(biāo)記的7株細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹

菌株003與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）strain IBK-11（MN428237.1:137-1333）在同一分枝上，Bootstrap驗(yàn)證表明支持度達(dá)到78%（圖2b），因此可以將分離菌株003鑒定為Staphylococcus epidermidis。菌株004與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）strain PB32（MN689679.1:166-1351）、PB41（MN689682.1:154-1339）、（MH591459.1:104-1289）在同一分枝上，Bootstrap驗(yàn)證表明支持度達(dá)到100%（圖2b），因此可以將004鑒定為Staphylococcus epidermidis）。菌株003、004在不同分枝上，顯示這兩株表皮葡萄球菌為不同來源的菌株。

菌株005與地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）strain B-9（MN756663.1:130-1318）、CRh49（MN726520.1:112-1300）、GT10B（MK100810.1:147-1335）在同一分枝上，Bootstrap驗(yàn)證它們的支持度達(dá)到100%（圖2b），因此可以將分離菌株005鑒定為Bacillus licheniformis。菌株006與Bacillus licheniformisstrain NFS-STR-7（MF079355.1）在同一分支上，Bootstrap驗(yàn)證它們的支持度達(dá)到100%（圖2c），因此可以將分離菌株006鑒定為Bacillus licheniformis。菌株005、006在不同一分枝上，顯示這兩株地衣芽孢桿菌為不同來源的菌株。

菌株007與Bacillus coagulansstrain SF1018（MN588271.1:41-1235）在同一分枝上，Bootstrap驗(yàn)證它們的支持度達(dá)到100%（圖2d），因此可以將分離菌株007鑒定為Bacillus coagulans。

2.3 MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果見表1

表1 分離菌種Autof ms1 000鑒定結(jié)果

如表1所示，分離菌株001、002鑒定結(jié)果為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），003、004鑒定結(jié)果為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），005、006鑒定結(jié)果為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），以上菌種鑒定結(jié)果得分＞9.0，為種水平置信。007鑒定結(jié)果為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans），鑒定結(jié)果得分為7.425，為屬水平置信。MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了16S rRNA基因序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果。結(jié)合形態(tài)特征，確定這7株菌中001、002為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、003、004為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、005、006為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、007為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。其中，兩株枯草芽孢桿菌（001、002）為相同來源菌，兩株表皮葡萄球菌（003、004）為不同來源菌、兩株地衣芽孢桿菌（005、006）為不同來源菌。

2.4 脹袋微生物產(chǎn)氣性能驗(yàn)證結(jié)果

分離菌株001～007接種滅菌土豆燒牛肉方便菜肴樣品，36 ℃培養(yǎng)3～7 d后，產(chǎn)氣脹袋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象觀察結(jié)果如表2。

如表2所示，產(chǎn)品接種001、002（枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis）菌液和005、006（地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis）菌液3 d后開始出現(xiàn)產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象，繼續(xù)培養(yǎng)至第5 d和第7 d后觀察，產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象更加明顯。接種003、004（表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis）和007（凝結(jié)芽孢桿菌Bacillus coagulans）菌液的產(chǎn)品和空白對(duì)照在培養(yǎng)過程中沒有觀察到產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象。說明枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是引起土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品脹袋的主要原因。

表2 脹袋微生物產(chǎn)氣脹袋驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

方便菜肴是在傳統(tǒng)中式菜肴的基礎(chǔ)上，選取特定的加工工藝進(jìn)行生產(chǎn)和殺菌，在保留原有色香味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的基礎(chǔ)上，還能夠在一定程度上延長(zhǎng)食品的儲(chǔ)存期。方便菜肴憑借其方便、快捷、營(yíng)養(yǎng)、衛(wèi)生、工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，吸引了越來越多的消費(fèi)者，其食品生產(chǎn)加工已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)。但因?yàn)槲⑸镂廴荆谫A藏期間，方便菜肴會(huì)出現(xiàn)脹袋和腐敗等較嚴(yán)重的質(zhì)量與安全問題。

MALDI-TOF MS技術(shù)用于微生物菌種鑒定具有成本低、檢測(cè)時(shí)間短、鑒定準(zhǔn)確性高、易于操作等優(yōu)點(diǎn)[15-16]。本研究以脹袋土豆燒牛肉方便菜肴微生物的分離和鑒定作為確認(rèn)產(chǎn)品脹袋原因分析的依據(jù)，通過微生物分離、純化和形態(tài)學(xué)觀察得到7株菌，進(jìn)一步利用MALDI-TOF-MS技術(shù)，驗(yàn)證了形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)的菌種鑒定結(jié)果，確認(rèn)脹袋微生物為5株芽孢桿菌屬細(xì)菌和2株表皮葡萄球菌（見表1）。

芽孢桿菌屬細(xì)菌，是一類產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌，好氧或兼性厭氧，能形成芽孢，存在于土壤、水、空氣等處，對(duì)高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強(qiáng)的耐受力，特別耐熱。食品加工中的滅菌或加熱工藝很難將其完全殺滅，該類菌是食品工業(yè)中較為重要的腐敗微生物。如高鵬等[17]從真空包裝肘花脹袋產(chǎn)品中分離鑒定芽孢桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬細(xì)菌是引起產(chǎn)品脹袋和腐敗變質(zhì)的主要原因。李靖等[18]研究證明解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是引起紅油豆瓣醬脹罐變質(zhì)的主要因素。李慧等[13]從脹桶番茄醬中分離出了厚壁類芽孢桿菌（Paenibacilluscineris）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）和蕈狀芽孢桿菌（Bacillus mycoides）。雖然這些產(chǎn)品與土豆燒牛肉方便菜肴生產(chǎn)工藝不盡相同，但相同的是豐富的營(yíng)養(yǎng)成分給微生物提供了適宜的生長(zhǎng)條件，導(dǎo)致這些微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生氣體，最終導(dǎo)致產(chǎn)品脹袋和腐敗變質(zhì)。本研究驗(yàn)證了引起本批次方便菜肴產(chǎn)品脹袋現(xiàn)象發(fā)生的是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品生產(chǎn)原料較多，包括牛肉、土豆塊、調(diào)味品和香辛料等，加工過程包括清洗、切塊、炒制、包裝和殺菌等過程，生產(chǎn)過程分區(qū)操作，包裝和殺菌過程無菌控制。研究分離鑒定的7株菌中，兩株枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的親緣關(guān)系，為同一來源的菌株，兩株地衣芽孢桿菌為不同來源的菌株，還有1株凝結(jié)芽孢桿菌和2株不同來源的表皮葡萄球菌。其中2株枯草芽孢桿菌和2株地衣芽孢桿菌可引起明顯的產(chǎn)氣脹袋現(xiàn)象（見表2）。因此，推斷加工原料和殺菌參數(shù)設(shè)置不合理是導(dǎo)致本研究土豆燒牛肉產(chǎn)品脹袋的主要原因。通過分析土豆燒牛肉方便菜肴脹袋微生物，有助于污染溯源分析，確認(rèn)生產(chǎn)關(guān)鍵控制點(diǎn)，加強(qiáng)對(duì)原料驗(yàn)收和生產(chǎn)加工過程關(guān)鍵環(huán)節(jié)的控制，并采用更科學(xué)的滅菌方法，避免經(jīng)濟(jì)損失和確保產(chǎn)品的質(zhì)量與安全。

4 結(jié)論

本研究對(duì)脹袋土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品中的微生物進(jìn)行分離、純化和鑒定。結(jié)果表明MALDI-TOF-MS技術(shù)可與微生物形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合用于脹袋食品污染微生物的快速及準(zhǔn)確鑒定。從脹袋土豆燒牛肉方便菜肴產(chǎn)品中分離了7株菌，鑒定結(jié)果為2株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），為同一來源菌；2株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），為不同來源菌；2株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），為不同來源菌；1株菌為凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）。產(chǎn)氣性能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌與樣品的脹袋有直接關(guān)系。生產(chǎn)過程要加強(qiáng)原料驗(yàn)收和殺菌參數(shù)的合理設(shè)置。

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