普通和凍干三七粉的有效成分及藥理作用比較

張君，孫思勉，趙琳，周航，林冬菊，霍小位

(河北大學 藥學院，河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室，河北 保定 071002)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F.H.Chen)為五加科植物三七的干燥根，又名田七，主產(chǎn)于中國云南、廣西.三七作為廣泛應用的中藥，其有效成分主要有揮發(fā)油、黃酮、氨基酸等，具有止血生肌、活血化瘀、消腫定痛、滋補、強壯、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用[1].雖然三七使用廣泛，但三七根莖、三七花的干燥仍以傳統(tǒng)方法為主，三七中的皂苷、三七素、氨基酸、揮發(fā)油等主要有效成分在高溫下易分解，引起活性物質(zhì)損失從而導致三七的藥效下降[2-3].真空冷凍干燥技術(shù)可以有效地保存三七等中藥的藥效成分[4-7].云南省食品藥品監(jiān)管局于2018年發(fā)布了三七(凍干)、三七顆粒(凍干)、三七粉(凍干)、三七切片(凍干)4個中藥飲片炮制規(guī)范，表明真空冷凍干燥技術(shù)已經(jīng)開始應用于炮制三七制劑.

真空冷凍干燥技術(shù), 就是將含水的中藥材或西藥材料凍結(jié)成固態(tài), 調(diào)整其溫度，在真空條件下冰就會升華成為水蒸氣, 從而將藥物中的水分清除, 達到理想的效果[8].目前, 凍干技術(shù)不僅用于血清、血漿、疫苗、酶、抗生素、激素等藥品以及食品的生產(chǎn), 而且在對性質(zhì)不穩(wěn)定的化學藥品和中藥新劑型研發(fā)中的應用也越來越多[9],還可以解決一些藥物新劑型長期儲存容易發(fā)生沉降、絮凝、聚結(jié)、變質(zhì)的問題，提高其穩(wěn)定性[10], 臨床治療效果良好的不少中藥制成凍干粉針后，其成型性、水溶性較注射液好，穩(wěn)定性大大提高[11]，天花粉、雙黃連等中藥粉針劑在臨床上的普遍應用就是明證[9].實驗證明真空冷凍干燥的三七，脫水徹底，干燥后的成品表面黃白色，質(zhì)輕，藥味濃[12].且從內(nèi)部結(jié)構(gòu)的保持和復水品質(zhì)角度來看，真空冷凍干燥切片具有較均一的多孔、疏松結(jié)構(gòu)，組織致密，復水時間短，復水比大，復水后口感佳，與新鮮三七差別最小，故真空冷凍干燥法優(yōu)于自然干燥法和熱風干燥法等傳統(tǒng)干燥法[12].

通過目前的固有制劑與其他藥物凍干粉或凍干制劑的比較來看，凍干粉對提高藥物療效和提升藥物的某些治療優(yōu)勢有明顯作用，而且可以從某些方面更好地保證藥物有效成分的完整度.本文將以三七為研究對象，通過對三七凍干粉和三七普通粉的有效成分分析及藥理作用比較研究，提出三七凍干粉的優(yōu)勢.

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF級昆明種健康小鼠，雄性，70只，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號：SCXK(魯)20140007.

1.2 藥品及試劑

三七普通粉和三七凍干粉(河北祁一堂藥業(yè)有限公司)；對二甲苯(天津市科密歐化學試劑有限公司)；人參皂苷Rg1標準(批號RG322803，合肥博美生物科技有限責任公司)；人參皂苷Rb1標準品(批號RG202004，合肥博美生物科技有限責任公司)；三七皂苷R1標準品(批號RG 202683，合肥博美生物科技有限責任公司)；乙腈(福晨(天津)化學試劑有限公司)；甲醇(福晨(天津)化學試劑有限公司).

1.3 實驗儀器

電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；一次性毛細玻璃管(華西醫(yī)科大學儀器廠生產(chǎn))；光學顯微鏡(制造商：Qimaging)；電子顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)；柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司)；示差折光檢測器(SHOKO CO.LTD)；高效液相色譜儀(北京鋼臣科技有限公司).

2 實驗方法

2.1 顯微鏡觀察

2.1.1 光學顯微鏡觀察

將三七普通粉末和三七凍干粉末均勻分散于載玻片上，置于光鏡下進行觀察，選取合適的放大倍數(shù)進行比對觀察.

2.1.2 電子顯微鏡觀察

將三七普通粉末和三七凍干粉末，分別借助于棉球直接撒落在載物片上，再用洗耳球輕吹試樣，除去附著的微粒，將載有微粒的載玻片翻轉(zhuǎn)，對準試樣臺，用小鑷子輕輕敲打，使顆粒均勻地落在試樣臺上，噴涂導電膜后，置于電鏡下進行觀察，選取合適的放大倍數(shù)進行比對觀察.

2.2 三七普通粉和三七凍干粉的溶解度考察

將三七普通粉和三七凍干粉配置成終質(zhì)量濃度相同的混懸液(終質(zhì)量濃度0.01 g/mL). 肉眼觀察其溶解度是否有明顯區(qū)別.

2.3 三七普通粉和凍干粉有效成分含量的測定

2.3.1 混合對照品儲備液的配制

精密稱取干燥至恒重的人參皂苷Rg1、 Rb1和三七皂苷R1對照品4.1、4.3、1.7 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備溶液.

2.3.2 供試品溶液的配制

精密稱定三七普通粉、三七凍干粉各0.5 g，置于50 mL的容量瓶中，用甲醇定容，稱定質(zhì)量，放置過夜，并將其超聲1 h，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得.

2.3.3 色譜條件

色譜柱：上海月旭UltimateXB-C18 (250 mm×4.6 mm)；柱溫25 ℃；檢測波長203 nm；體積流量1.0 mL/min；進樣量30 μL；流動相為乙腈(A)-水(B)，采用梯度洗脫，0～12 min，A-B (體積比為19∶81)，12～70 min (體積比為36∶64).

2.3.4 標準曲線的測定

混合對照品溶液分別稀釋0.75、2、4、6、10倍，在上述色譜條件下進樣測定.以進樣質(zhì)量濃度x(μg/mL)為橫坐標，峰面積積分值y為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到3種對照品的線性回歸方程.三七皂苷R1在17～170 μg/mL與其峰面積之間呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=19 287x-34.752，r=0.999 1;人參皂苷Rg1在41～410 μg/mL與其峰面積之間呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=30 228x-114.76，r=0.999 5；人參皂苷Rb1在43～430 μg/mL與其峰面積之間呈良好的線性關(guān)系,標準曲線為y=16 005x-48.407，r=0.999 8.

2.4 三七普通粉和三七凍干粉的藥理作用比較

2.4.1 動物分組及給藥

小鼠按體重隨機分為7組，每組10只：空白對照組、普通三七粉高劑量組(2 g/kg)、普通三七粉中劑量組(1 g/kg)、普通三七粉低劑量組(0.5 g/kg)、三七凍干粉高劑量組(2 g/kg)、三七凍干粉中劑量組(1 g/kg)、三七凍干粉低劑量組(0.5 g/kg).按10 g體質(zhì)量灌胃給藥0.2 mL，每天1次，連續(xù)給藥10 d.每2天稱量1次體質(zhì)量.

2.4.2 毛細玻管法測凝血時間

末次給藥30 min后，用毛細玻管插入小鼠眼球靜脈叢，自血液流進玻管內(nèi)計時，待血柱約5 cm時取出毛細玻管，平放于實驗桌上，每隔30 s折斷毛細玻管兩端約0.5 cm，并緩慢向左右拉開，觀察斷端有無凝血絲，記錄從毛細玻管采血至出現(xiàn)凝血絲的時間即為凝血時間.

2.4.3 剪尾法測出血時間

末次給藥30 min后，將每只小鼠尾尖剪掉約1 cm，待血液自行溢出時開始計時.每隔30 s用濾紙輕輕吸去血滴，直至濾紙吸時無血為止，即為出血時間.

2.4.4 耳腫脹實驗測定抗炎作用

末次給藥30 min后，用二甲苯50 μL均勻涂抹每只鼠的右耳，30 min后頸部脫臼處死，分別用打孔器取相同部位左右耳片，分析天平稱重，以左右耳片差值為腫脹度，計算腫脹率，腫脹率=(右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量)/左耳質(zhì)量×100%.

2.4.5 不同三七粉對小鼠免疫器官的影響

不同三七粉給藥組小鼠頸部脫臼處死后，迅速解剖，摘取小鼠的脾臟和胸腺，稱取每個器官的質(zhì)量，計算器官指數(shù).器官指數(shù)=器官質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g).

2.5 統(tǒng)計學分析

3 實驗結(jié)果

3.1 顯微鏡觀察結(jié)果

3.1.1 光學顯微鏡觀察

如圖1所示，在光鏡下觀察，三七普通細粉顆粒大小不均，顆粒聚集明顯，形態(tài)各異，圖1中散布極細粉等現(xiàn)象.與三七普通粉相比，三七凍干粉大小分布較均勻，形態(tài)多呈橢圓形，少見聚集.由光鏡結(jié)果可知，三七凍干粉的顆粒更為分散細膩.

粒徑為20 μm；物鏡：UPLFLN 40×/0.75.圖1 光鏡下三七普通粉(a)、三七凍干粉(b)形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of ordinary P. notoginseng powder(a)lyophilized P. notoginseng powder(b)under light microscope

3.1.2 電子顯微鏡觀察

如圖2所示，在電子顯微鏡下觀察，三七普通細粉顆粒大小差異明顯，出現(xiàn)顆粒聚集，顆粒邊緣較為鋒利的特征.而三七凍干粉顆粒大小較為均勻，邊緣較為圓潤，少見聚集，顆粒更為分散.由此可見，凍干粉粉碎后的顆粒更為細膩均勻.

3.2 溶解度觀察

如圖3所示，在2種粉末溶液配制終質(zhì)量濃度相同的情況下，三七普通粉混懸液溶液較為透明，瓶底顆粒沉積現(xiàn)象明顯，溶解度較差.而三七凍干粉粉末溶液更為渾濁，呈現(xiàn)明顯的混懸狀態(tài)，表明溶液的分散更為均勻.

粒徑為100 μm；普通粉630×；凍干粉860×.圖2 電子顯微鏡下三七普通粉(a) 三七凍干粉(b)的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of ordinary P. notoginseng powder (a)lyophilized P. notoginseng powder(b)under electron microscope

圖3 三七普通細粉混懸液(a) 三七凍干粉混懸液(b)Fig.3 Suspension of ordinary P. notoginseng powder (a)suspension of lyophilized P. notoginseng powder(b)

3.3 三七粉和凍干粉有效成分的含量測定

經(jīng)高效液相色譜分析檢測，結(jié)果見圖4. 三七普通粉中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的質(zhì)量分數(shù)分別為11.2、29.0、39.6 mg/g；三七凍干粉中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的質(zhì)量分數(shù)分別為9.6、32.2、34.0 mg/g.

由此可得，三七普通粉的三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量較三七凍干粉各高出14.3%和14.1%，而人參皂苷Rg1的含量則低于三七凍干粉10%.

1.三七皂苷Rl；2.人參皂苷Rgl；3.人參皂苷Rbl.圖4 混合對照品(a)、三七普通粉(b)和三七凍干粉(c)的HPLC譜 (n=3)Fig.4 HPLC atlas of mixed reference(a)、ordinary P. notoginseng powder (b)and lyophilized P. notoginseng powder(c)

3.4 三七普通粉和凍干粉對小鼠體質(zhì)量的影響

如圖5所示，給藥期間，各組小鼠之間的體質(zhì)量沒有顯著性差異，表明各給藥組小鼠均沒有出現(xiàn)明顯的毒性反應.

圖5 實驗動物體質(zhì)量變化(n=10)Fig.5 Changes in body mass of experimental animal (n=10)

3.5 三七普通粉和凍干粉對小鼠凝血實驗的影響

如表1所示，與空白對照組比較，普通粉高劑量組能夠明顯縮短凝血時間(P<0.05)，其他給藥組沒有顯著性差異，表明普通粉高劑量組有一定的凝血作用.

表1 普通三七粉與凍干三七粉對小鼠出血時間及凝血時間的影響(mean±SD,n=10)

3.6 三七普通粉和凍干粉對小鼠耳部腫脹實驗的影響

如表2所示，凍干粉高劑量組能夠明顯減輕二甲苯所致小鼠耳腫脹的腫脹度，與空白組比較有顯著性差異(P<0.05)，表明凍干粉高劑量組有一定的抗炎作用.該組的腫脹率也較低，但是與空白對照組比較沒有顯著性差異.

表2 普通三七粉與凍干三七粉對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響(mean±SD,n=10)

3.7 三七普通粉和凍干粉對小鼠免疫器官的影響

如表3所示，各給藥組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)與空白對照組比較沒有顯著性變化，表明三七普通粉和凍干粉對小鼠的免疫器官均沒有顯著影響.

表3 普通三七粉與凍干三七粉對小鼠免疫器官指數(shù)的影響(mean±SD,n=10)

4 結(jié)果與討論

冷凍干燥技術(shù)的干燥效果好，對物質(zhì)的影響較小，是生物活性物質(zhì)和許多中藥材較理想的干燥方法.凍干能夠使物質(zhì)中的熱敏成分，例如蛋白質(zhì)、微生物和其他生物活性成分得到保護，減少易揮發(fā)及易氧化成分的損失，最大限度地保持物質(zhì)原本的性狀.凍干粉加水后溶解迅速而完全.此外，在藥材凍干之后進行真空或氮氣封口，以隔絕氧氣，低溫存放，能延長藥材的保存時間[13].本實驗研究結(jié)果顯示，三七凍干粉較三七普通粉，顆粒大小更為均勻，邊緣更為圓潤，少見聚集，顆粒更為分散細膩.溶解度觀察結(jié)果顯示凍干粉溶液的分散更為均勻，進一步明確了三七凍干粉在顆粒均一性及溶解度方面的優(yōu)勢.

現(xiàn)代研究表明普通三七粉干燥過程極易破壞其內(nèi)含的皂苷和揮發(fā)油等活性成分，影響三七的藥用價值和療效，而凍干三七粉能有效地將這些成分保留下來[14].而且凍干三七粉含水量少，同等質(zhì)量，凍干三七粉的活性成分含量較高. 因此，凍干三七粉給生產(chǎn)生活帶來便利的同時將降低三七炮制過程中有效成分的損失[15].在本研究中HPLC的實驗結(jié)果也顯示三七凍干粉與三七普通粉的有效成分含量不同，三七普通粉的三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量較三七凍干粉分別高出14.3%和14.1%，而三七凍干粉中人參皂苷Rg1的含量則高于普通粉10%. 以上結(jié)果表明，三七凍干粉與三七普通粉有效成分的含量存在差異，而有效成分含量的差異可能造成其藥理活性的差異.目前，對三七凍干粉的藥理活性優(yōu)勢的闡述并不清楚.

在本研究中，動物實驗結(jié)果顯示，三七普通粉的抗凝血作用較為明顯，而三七凍干粉的抗炎作用明顯優(yōu)于三七普通粉，因此三七普通粉與三七凍干粉的藥理活性存在明顯差異.據(jù)報道，三七總皂苷具有良好的抗凝血效果，三七總皂苷中又以三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1 3種成分的含量最高. 此外，三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1均能夠降低炎癥因子的表達[16-19]，有明顯的抗炎作用. 因此，三七凍干粉與三七普通粉藥理活性的差異可能與其有效成分的含量存在差異有關(guān)，具體的作用機制仍有待深入研究.

綜上所述，三七普通粉與三七凍干粉在顆粒均一性、溶解度、有效成分含量及藥理活性方面存在差異.其中，三七凍干粉在顆粒均一性及溶解度方面具有優(yōu)勢，其人參皂苷Rg1的含量較普通粉高，而三七皂苷R1和人參皂苷Rb1含量較三七普通粉低. 此外，三七普通粉有明顯的促凝血作用，而三七凍干粉則顯示出一定的抗炎活性.本研究首次系統(tǒng)的闡述了三七普通粉和三七凍干粉在有效成分及藥理活性方面的差異，將為三七凍干粉和三七普通粉的應用提供一定的科學依據(jù).