蛋白質組學揭示宰前溫和驅趕改善豬肉品質的潛在機制

鄒 波，何廣捷，趙 迪，閆 靜，張 澤，徐幸蓮，周光宏，李春保*

（南京農業大學食品科學技術學院，肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，農業農村部肉品加工重點實驗室，江蘇 南京 210095）

豬肉品質與宰前應激密切相關，應激來源包括生豬運輸、入欄、驅趕、季節、宰殺方式等[1-3]。不當的宰前管理方式會給動物造成強烈應激[4]，從而加劇機體細胞無氧呼吸程度以及肌肉能量代謝進程，導致肌肉中的糖原大量消耗，乳酸迅速積累，最終造成肌肉pH值迅速下降。較低的pH值會導致肌原纖維蛋白變性，肌肉收縮功能改變，持水力下降，大量的水分從肌肉表面溢出，在極端情況下就會形成PSE（pale, soft, exudative）肉[5-6]。

宰前驅趕是生豬屠宰過程中必不可少的過程，其涉及屠宰場的眾多區域，包括卸載區域、驅趕通道以及電擊區域等[7]。國內生豬驅趕基本以人工為主，并運用各種輔助工具如趕豬板、電擊棍等，在宰前驅趕的方式和設備方面沒有創新性的發展[8]。歐美等國家有為畜禽驅趕精心設計的專用系統，能夠很好地保證驅趕過程溫和地進行[9]。雖然歐美等國家在這方面設計更加精細合理，但在驅趕過程中避免不了對生豬進行恐嚇與拍打。目前，大多數國家傳統的驅趕方式仍然是利用電擊、鞭打等方式驅趕生豬快速前行[10-11]，動物應激非常嚴重[12]。而在大型屠宰場，由于同一時間內驅趕大批生豬，宰前驅趕應激將變得更加嚴重。所以，相對溫和的驅趕方式更為合理，溫和驅趕是指避免生豬遭遇大量或強烈的宰前應激驅趕方式，包括利用擋板讓生豬自由前行的完全溫和驅趕方式以及如利用聲音驅趕生豬前行的其他驅趕方式[13]。然而，關于溫和的驅趕方式如何減少宰前應激，進而改善肉品品質的具體機制尚未明確。所以有必要對此進行更深入的研究。

蛋白質組學是一種非常重要的現代生物鑒定技術，可以鑒定和探究一個細胞或組織所表達的全部蛋白質及它們的表達方式和調控規律，是對機體在蛋白水平定量、動態、相互作用的全面研究[14]。利用蛋白質組學對肌肉細胞中各種蛋白質的識別和定量，可確定它們在細胞內外的定位、活性和相互作用，進而探索宰前驅趕應激對肌肉細胞中催化酶或調控蛋白的調控作用，并能夠有效地闡明溫和驅趕改善肉品品質的機制。

因此，本實驗對比研究了完全溫和驅趕、聲音溫和驅趕及傳統驅趕方式對生豬應激程度、肉品品質以及宰后肌肉能量代謝的影響，并利用蛋白質組學分析肌肉能量代謝與肌肉收縮相關的差異蛋白，旨在探索溫和驅趕改善肉品品質的潛在機制，以期為企業的生產提供理論和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三元雜交公豬，180 日齡（已去勢），由江蘇某屠宰企業提供。

血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌糖原試劑盒、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）、皮質醇（cortisol，CORT）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；ATP測定試劑盒 碧云天生物技術研究所；尿素、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES）、β-甘油磷酸鈉、釩酸鈉、焦磷酸鈉、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、三氟乙酸、甲酸 美國西格瑪奧德里奇有限公司；胰蛋白酶美國Promega公司；SEP PAK Classic C18固相萃取柱美國Waters公司；BCA試劑盒 美國Pierce公司。

1.2 儀器與設備

M2e多功能酶標儀 美國MD公司；Avanti J-E高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；pH計 德國Testo公司；漩渦儀 上海滬西分析儀器有限公司；純水機、LTQ-Orbitraq XL納升級液相色譜串聯質譜（nanoliquid chromatography tandem mass spectrometry，Nano-LCMS/MS） 美國Thermo公司；AUY120電子分析天平日本島津公司；均質器破碎儀 法國Bertin公司；色差儀 日本柯尼卡美能達公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計及分組

完全溫和驅趕（mild driving，MD）組（以下稱全溫組）：工人不對生豬進行任何電擊和拍打行為，僅利用擋板向前推進，生豬自由向靜養圈以及電擊區域移動；聲音溫和驅趕（sound driving，SD）組（以下稱聲溫組）：工人利用驅趕聲音代替電擊棍和皮鞭，敦促生豬向前快速行走；傳統驅趕（traditional driving，TD）組（以下稱傳統組）：根據屠宰場現有驅趕流程，生豬在電擊、鞭打下進入靜養和電擊區域。每個處理組15 頭生豬。電擊暈后取其血液，3 000 r/min離心10 min取上清液，獲得血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中；同時取背最長肌置于4 ℃冷庫中，分別在宰后45 min和3、12、24 h取10 g肉樣（去除筋膜、脂肪、結締組織）于凍存管，并放入液氮，之后保存于-80 ℃冰箱中用于測定糖原、ATP以及蛋白質組學分析；剩余肉樣置于4 ℃貯存，用于測定肉色、pH值、蒸煮損失。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 血清CK活力的測定

血清CK活力測定按照試劑盒說明書的操作步驟，取20 μL血清樣品于2 mL離心管中，加入300 μL三磷酸腺苷和肌酸溶液，提供的試劑，混勻并37 ℃水浴，再加入100 μL鉬酸銨，3 500 r/min離心10 min，之后利用定磷劑顯色后，45 ℃水浴15 min，在660 nm波長處測定吸光度[15]。每個樣品測3 次，取平均值。

1.3.2.2 LDH活力的測定

LDH活力測定按照試劑盒的操作步驟，取20 μL血清于10 mL離心管中，分別加入雙蒸水、標準溶液20 μL，再加入基質緩沖液50 μL并于37 ℃水浴15 min，之后用250 μL 2,4-二硝基苯肼顯色并在37 ℃水浴中孵育15 min，加入2.5 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，在660 nm波長處測定吸光度[16]。每個樣品測3 次，取平均值。

1.3.2.3 HSP70及CORT質量濃度的測定

HSP70及CORT質量濃度的測定按照ELISA試劑盒的操作步驟，分別將50 μL樣品和標準品加入含有抗體的96 孔板中，然后加入生物抗原工作液，37 ℃孵育30 min，用洗滌液清洗5 次，拍干；加入50 μL親和素-HRP，37 ℃反應30 min，洗板5 次，再加入顯色液A、B，37 ℃顯色10 min，加入終止液，450 nm波長處讀取吸光度[17-18]。每個樣品測3 次，取平均值。

1.3.2.4 肉的顏色測定

參照NY/T 2793—2015《肉的食用品質客觀評價方法》[19]：沿肌纖維垂直方向切取厚度不低于2.0 cm的肉塊，將肉樣平放在紅色塑料板或托盤上，新切面朝上。之后，置于-1.5～7 ℃環境中避光靜置25～30 min。然后將色差儀的鏡頭垂直置于肉面上，鏡頭緊扣肉面（不能漏光）。測量時保持樣品表面平整，避開結締組織，分別記錄肉樣的亮度L*值、紅度a*值、黃度b*值。每個樣品重復3 次，取平均值。

1.3.2.5 蒸煮損失率的測定

參照NY/T 2793—2015[19]：樣品在4 ℃冷庫中存放24 h后取出，放在室溫下平衡0.5 h。然后沿著與肌肉自然走向（肌肉的長軸）垂直的方向切取2.54 cm厚的肉塊，并去除樣品表面的結締組織、脂肪和肌膜，使其表面平整。將肉塊放入塑料蒸煮袋中，將溫度計探頭由上而下插入肉塊中心，記錄肉塊的初始溫度，將蒸煮袋口密封起來。將包裝的肉塊放入72 ℃水浴中，水浴液面需完全浸沒肉塊，袋口不得浸入水中。當肉塊中心溫度達到70 ℃時，立即取出肉樣，冷卻稱質量。肉塊蒸煮前后的質量損失占原質量的比例即為蒸煮損失率。每個樣品測3 次，取其平均值。

1.3.2.6 pH值測定

參照NY/T 2793—2015[19]：將校準后的便攜式pH計金屬頭直接插入肉塊中（避開結締組織、血瘀和可見脂肪），待pH計讀數穩定后，讀取數值。每個樣品測3 次，取平均值。

1.3.2.7 糖原含量測定

按照試劑盒的操作步驟稍作改進。將肉樣從-80 ℃取出，每個肉樣取適量質量切碎，再準確稱取90 mg放入0.27 mL KOH溶液中，沸水浴20 min，再將溶液稀釋16 倍，加入顯色液，沸水浴5 min，冷卻后于620 nm波長處測定吸光度[20-21]。

1.3.2.8 ATP含量測定

切取100 mg肉樣放入ATP裂解液中，用均質器破碎儀在低溫條件下將組織勻漿。裂解后，4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清液用于后續測定。利用ATP標準品分別配制成0.002、0.005、0.01、0.05、0.1 μg/mL的ATP標準溶液。每個樣品及標準品取20 μL加入ATP工作液中，用多功能酶標儀測定每個樣品的Luminometer（RLU）值[22]。

1.3.2.9 蛋白質組學分析

每組隨機抽取8 頭生豬，對宰后45 min樣品進行蛋白質組學分析，蛋白提取采用Svinkina等[23]的方法并做適當修改。將100 mg的肉樣放入10 mL的尿素裂解液（9 mol/L尿素、20 mmol/L HEPES、1 mmol/L β-甘油磷酸鈉、1 mmol/L釩酸鈉、2.5 mmol/L焦磷酸鈉）中勻漿，之后于20 000×g離心15 min。取1 mL上清液，加入3.6 μL 1.25 mol/L二硫蘇糖醇，55 ℃下還原30 min。加入20 μL 0.5 mol/L碘乙酰胺在20 ℃下烷基化15 min。之后用20 mmol/L HEPES（pH 8.0）將樣品稀釋4 倍，加入40 μL 1 mg/mL胰蛋白酶消化過夜。取出消化好的肽，用200 μL 20%三氟乙酸進行酸化，并用C18脫鹽柱脫鹽純化。最后用2 mL洗脫液（含體積分數40%乙腈、0.1%三氟乙酸）洗脫肽段，真空干燥后，-80 ℃保存。

質譜分析按照Shi Xuebin等[24]的方法，采用LTQ-Orbitraq XL Nano-LC-MS/MS進行分析。真空干燥后的樣品在130 μL體積分數0.1%甲酸溶液中充分溶解，利用Nano-LC系統將2 μg的肽段加入到C18trap column中。隨后，肽段被洗脫到Acclaim PepMap?C18分析柱中，在250 nL/min流速下運行120 min。原始質譜數據用MaxQuant 1.5.0.30軟件分析[25]，物種為豬（Sus scrofa）（88 375 個蛋白序列）。差異表達蛋白的篩選依據是fold change不低于1.5或不高于0.667，P＜0.05。

1.4 數據統計處理

采用SAS 9.2統計分析軟件對血液、肉品品質指標進行單因素方差分析，用OmicsBean軟件對蛋白質組學數據進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 不同驅趕方式對血液生化指標的影響

動物在正常的生理情況下，細胞沒有受到損壞，其細胞膜起到屏障作用，CK與LDH主要存在于胞內；在應激狀態下，細胞膜遭到破壞，兩種酶會被釋放進入到血液中[26]。與此同時，應激刺激大腦，進而通過邊緣系統、下丘腦到達腎上腺皮質，最終導致糖皮質激素的分泌，其中就包括CORT[27]。由圖1可知，與傳統驅趕方式相比，全溫組中CK、LDH活力以及CORT質量濃度顯著下降（P＜0.05）,而HSP70質量濃度沒有顯著差異（P＞0.05）；聲溫組中CK、LDH活力均處于中間水平。趙慧等[28]研究生豬在強烈的應激情況下同樣發現血液中的CK、LDH、COR含量均顯著升高，龍定彪等[29]發現宰前受到較低應激的生豬，其血液中的CK、LDH活力顯著下降。

圖1 不同驅趕應激下血液應激指標的變化Fig. 1 Changes in stress-related blood indicators under different driving stress conditions

2.2 不同驅趕應激對肌肉品質指標的影響

表1 不同驅趕應激對肌肉品質的影響Table 1 Effects of different driving stress treatments on muscle quality

顏色是肉的重要品質指標，會影響消費者的購買欲望[30]。由表1可以看出，全溫組和聲溫組的紅度a*值和黃度b*值都顯著高于傳統組（P＜0.05），而亮度L*值沒有顯著差異。這表明傳統組的肉色相對其他兩組更加蒼白。同樣全溫組和聲溫組的蒸煮損失率顯著低于傳統組（P＜0.05），持水性能更好。為了更客觀地反映兩組之間肉品質量的差異，依據宰后45 min的pH值判定PSE肉的發生率（pH45min＜6.0）[31]，可以看出全溫組及聲溫組沒有PSE，而傳統組為3 例。在宰后45 min和3 h后，全溫組和聲溫組的pH值顯著高于傳統組（P＜0.05），宰后短時間內pH值沒有快速下降。宰后12 h后，pH值都處于較低的值，3 組之間沒有顯著差異（P＞0.05）。同樣朱良齊等[32]調研生豬宰前的環境對PSE肉發生率的影響，發現較為強烈的應激環境之下，PSE肉發生率較高，宰后早期pH值下降迅速。

2.3 不同驅趕應激對肌肉理化指標的影響

圖2 不同驅趕應激下肌肉糖原和ATP含量的變化Fig. 2 Changes in muscle glycogen and ATP contents under different driving stress conditions

動物屠宰之后，其肌肉細胞氧氣供應停止，細胞的呼吸方式轉變為無氧呼吸。而在屠宰之前受到較大應激會導致生豬體內肌糖原和ATP消耗過度，宰后初期形成較低的pH值[31]。所以對宰后肌肉糖原和ATP的測定至關重要。宰后45 min和3 h，全溫組的糖原和ATP含量顯著高于傳統組（P＜0.05）（圖2）。而聲溫組中的生豬由于受到一定的應激，其糖原和ATP含量處于中間水平。宰后12 h和24 h，全溫組的糖原含量仍然顯著高于其他兩組（P＜0.05）,但ATP含量沒有顯著性差異（P＞0.05）。這與Li Xiao等[33]研究結果類似，PSE肉發生率越高，糖原和ATP的含量下降迅速。

2.4 蛋白質組學分析結果

2.4.1 蛋白質組整體蛋白差異分析結果

圖3A為原始的蛋白表達譜，歸一化處理后，蛋白表達量的中間值保持在一個標準合理的數值范圍內（圖3B），以進行后續分析。圖3C的主成分分析圖顯示，全溫組樣品和聲溫組樣品有一定的區分度，聲溫組受到一定的應激，但傳統組樣品與其他兩組樣品呈現顯著差異。

2.4.2 具體差異蛋白分析結果

圖4 差異蛋白及樣品之間的差異程度Fig. 4 Analysis of proteins that differed between MD and TD groups

全溫組、聲溫組和傳統組總共鑒定到170 種蛋白，其中46 種蛋白發生差異表達。如ATP依賴性6-磷酸果糖激酶（ATP-dependent 6-phosphofructokinase，PFKM）、α-1,4-葡聚糖磷酸化酶（α-1,4-glucan phosphorylase，PYGM）、糖原脫支酶（glycogen debranching enzyme，AGL）等與能量代謝相關的蛋白以及MYH1、肌球蛋白7（myosin-7，MYH7）等肌肉收縮相關蛋白。圖4顯示了46 種差異蛋白在各個樣品間的具體差異程度，可以看出傳統組中的眾多蛋白與其他兩組區分明顯，聲溫組與全溫組中的一些蛋白也有差異。

2.4.3 差異蛋白生物功能分析結果

圖5 差異蛋白的GO功能富集分析Fig. 5 Gene ontology enrichment of differential proteins

GO（gene ontology）富集分析表明46 個差異表達蛋白富集到的286 個生物過程、64 個細胞組分和113 種分子功能產生差異，包括碳水化合物分解代謝過程和肌肉收縮（圖5A）。在生物過程方面，3 種處理組在單組織碳水化合物代謝過程、糖原分解代謝過程方面存在顯著差異，這些生物過程調控能量代謝，其相關的基因（蛋白）數量為2～7 個（圖5B）；圖5C顯示，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、PYGM和PFKM等蛋白在這些能量代謝生物過程中發揮關鍵作用。在細胞組分方面，收縮纖維、肌原纖維等與肌肉收縮相關的細胞成分差異顯著，所涉及的基因（蛋白）數在7～31之間（圖5D），輔肌動蛋白α2（actinin alpha 2，ACTN2）、MYH7和原肌球蛋白（tropomyosin 3，TPM3）等蛋白對細胞組分的差異有很大的貢獻（圖5E）。分子功能差異顯著的包括小分子結合、氨基酸結合、骨架蛋白結合等（圖5F），參與的蛋白有PYGM、ACTN2、MYH1和GAPDH等（圖5G）。

為了探究導致不同肉品品質形成的具體代謝通路，需要對差異蛋白進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway analysis）通路分析。與傳統組相比，完全溫和處理和聲音溫和處理極顯著改變了碳代謝、糖酵解、緊密連接等通路途徑（P＜0.01）（圖6A）。參與調控相關代謝通路的PFKM、ACTN2、PYGM、GAPDH、TPM3、線粒體肌酸激酶2（mitochondrial creatine kinase 2，CKMT2）等蛋白下調，類突觸小泡蛋白2（synaptophysin like 2，SYPL2）、鈣調素（regucalcin，RGN）、MYH1上調（圖6B）。

圖6 差異蛋白KEGG通路分析Fig. 6 KEGG pathway analysis of differential proteins

由蛋白交互網絡圖分析發現23 個差異表達蛋白和10 種KEGG通路之間有相互作用。中心網絡圖表明與能量代謝（PFKM、AGL、異檸檬酸脫氫酶2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH1）、CKMT2、GAPDH、磷酸甘油酸激酶1（phosphoglycerate kinase 1，PGK1）、PYGM）以及肌肉收縮相關（ACTN2、MYL1、絲切蛋白（cofilin 2，CFL2）、MYH1、MYH7、TPM3）蛋白存在眾多交互作用。其中，糖酵解、碳代謝、緊密連接等通路與蛋白之間相互作用明顯，參與調控肌肉品質的形成（圖7）。

圖7 差異蛋白交互網絡圖Fig. 7 Protein-protein interaction network of differential proteins

在全溫組和聲溫組中，19 種上調蛋白與細胞組分及氨基酸合成代謝相關（如腺苷高半胱氨酸酶（adenosylhomocysteinase，AHCY）、RGN、PDLIM3），維持細胞正常的生物活性。例如，AHCY參與葡萄糖醛酸鹽合成l-抗壞血酸的子通路的第3步，是催化抗壞血酸生物合成的關鍵步驟，對維持細胞的正?；钚云鹬匾饔谩Ａ硗?，傳統組中有27 個上調蛋白與能量代謝和骨骼肌調節相關（PFKM、PYGM、GAPDH、PGK1、AGL、LDH2、ACTN2、TPM3、MYL1、CFL2）。PFKM通過ATP催化D-果糖6-磷酸為果糖-1,6-二磷酸，這是糖酵解的第一個關鍵步驟[34-35]。PYGM和AGL參與調節糖原代謝、葡萄糖代謝等多種能量通路，其表達量的增加將促進肌肉能量代謝進程[36-37]。GAPDH是3-磷酸甘油醛氧化反應的催化酶，此反應是D-甘油醛-3-磷酸合成丙酮酸第一步子途徑，對糖酵解途徑的進程起到重要的調控作用。GAPDH能夠催化3-磷酸甘油醛氧化脫氫并磷酸化生成含有1 個高能磷酸鍵的1,3-二磷酸甘油酸，脫下的氫和電子轉給脫氫酶的輔酶NAD＋生成NADH＋和H＋。傳統組中GAPDH表達量的增加促進了3-磷酸甘油醛氧化反應。PGK1是催化1,3-二磷酸甘油酸的高能磷酸鍵轉移反應的關鍵酶。在PGK1的催化下，1,3-二磷酸甘油酸將會生成3-磷酸甘油酸，同時其C1上的高能磷酸根轉移給ADP直接生成ATP。此激酶催化的反應是可逆的，也是D-甘油醛-3-磷酸合成丙酮酸的子途徑的第2步。傳統組肌肉中PGK1催化酶表達量的增加能夠將經過GAPDH加速催化后的糖酵解途徑進一步加速催化，底物向丙酮酸的轉化速率不斷加快。IDH2和CKMT2也參與能量代謝，調控肌肉品質形成。以上結果表明，傳統驅趕產生強烈的驅動應激會導致肌肉當中PFKM、PYFM、GAPDH、PGK1、AGL、IDH2、CKMT2等蛋白的高表達，進而加速能量代謝。相反，完全溫和驅趕和聲音溫和驅趕可以緩解宰前應激，抑制能量代謝相關蛋白的高表達，緩解能量代謝速率。與此同時，肌肉收縮相關蛋白也參與調控肉品品質的形成。ACTN2和MYH7與肌動蛋白結合和鈣離子結合有關，對肌肉收縮有重要影響。傳統組中這兩種上調蛋白可能改變肌肉的收縮功能，導致持水力下降，進而影響肉品質量。另外，聲音溫和組中GAPDH、AGL、PYGM等能量代謝相關的蛋白的表達量高于完全溫和組，這說明從蛋白組角度分析，聲音驅趕還是造成生豬一定程度宰前應激并加速了糖原和ATP的部分消耗。Kiran等[38]對宰后牛肉的蛋白質組進行研究，發現丙酮酸脫氫酶E1組分亞單位、PGK1和磷酸甘油酸突變酶2在急性宰前應激下表達量升高，加速糖酵解過程。另外，以往的蛋白質組研究也表明不同宰前管理方式影響與能量代謝和肌肉收縮相關的蛋白表達[39]。然而，不同類型的應激可能導致不同的蛋白質表達，特別是能量代謝和肌肉收縮相關蛋白，這需要進一步的研究來解釋其潛在機制。綜上所述，完全溫和驅趕和聲音溫和驅趕降低了參與能量代謝和肌肉收縮相關蛋白的表達，減緩了肌肉糖原和ATP的消耗，維持了宰后肌肉正常的pH值。正常的pH值以及相對較低表達的肌肉收縮相關蛋白保證了溫和組肌肉良好的持水能力和正常的肉色，減少PSE肉的發生率（圖8）。

圖8 溫和驅趕改善豬肉品質的潛在機制Fig. 8 Mechanism for improving pork quality by mild driving

3 結 論

本實驗對比研究了完全溫和驅趕、聲音溫和驅趕和傳統驅趕這3 種方式對生豬血液應激指標和肉品質的影響。發現相對于傳統驅趕，完全溫和驅趕和聲音溫和驅趕能夠有效降低生豬血液應激相關的酶活性，并降低肌肉中能量代謝和肌肉收縮相關蛋白的表達，減緩宰前肌肉能量的快速消耗，從而降低PSE肉的發生率。與此同時，聲音溫和驅趕也會帶來一定程度上的應激。因此，肉品生產企業應當重視生豬宰前管理中的驅趕環節，做出必要的改進以減少生豬在此環節的應激反應，提升肉品質。