原花青素對鐵超載大鼠腎臟鐵含量、氧化應激及Fas、Bax基因表達的影響

云少君，褚東陽，何興帥，張文芳，馮翠萍*

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西 太谷 030801）

鐵元素廣泛存在于各種生物體中[1-2]。體內鐵過量除會發生Fenton反應外[3]，還能夠直接和不飽和脂肪酸結合，導致脂質過氧化[4]。體內過量的鐵可以在多種組織諸如肝臟、心臟和腎臟中蓄積，導致相應臟器的氧化損傷。研究表明，體內鐵過量可以引起腎臟功能性異常，如尿毒癥和腎癌等[5-6]。因此，體內鐵代謝的平衡對于機體的健康是至關重要的。

目前臨床上對抗鐵負荷的方法主要是采用藥物治療，多采用一些重金屬螯合劑[7]，如去鐵胺、去鐵酮等。藥物的治療雖然迅速有效，但是多伴隨著如皮膚紅疹、惡心、嘔吐等副作用。此外，機體抗氧化能力的提升也被認為是對抗鐵負荷所致氧化損傷的有效措施，已有研究表明，使用抗氧化蛋白[8]、大麻二酚[9]以及金花草[10]等一些中草藥都能夠改善鐵過量造成的損傷。

原花青素（proanthocyanidins，PAs）擁有很強的生物活性和藥理作用[11-13]。體內外實驗均表明，PAs能夠抑制自由基生成，提高抗氧化酶的活性，其清除氧自由基的能力要強于VC、VE以及β-胡蘿卜素[14-15]。同時，PAs所含的酚類結構亦是有效的鐵螯合劑[16]。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSPAs）含量豐富，其作為營養補充劑被人們廣泛使用。而本課題組之前的實驗結果表明GSPAs能夠抑制大鼠吸收大豆鐵蛋白中的鐵；在單純給予缺鐵大鼠安全攝入量范圍的GSPAs后，缺鐵大鼠均出現死亡現象，而缺鐵對照組大鼠則未出現死亡現象[17]。目前，針對PAs的研究多集中在其抗氧化特性上，對于其如何影響機體鐵代謝尚不清楚，而過量的鐵會對腎臟功能產生損傷，原花青素是否對這一作用有抑制和改善作用尚未得知。因此，本實驗擬通過構建鐵超載大鼠模型，進一步探究GSPAs對鐵超載的營養改善作用及其機制，為開發安全、高效的控鐵制劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性SD大鼠（8 周齡）由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2012-0001。

GSPAs（多聚體純度為95%） 天津尖峰有限責任公司；血清總鐵結合力（total iron binding capacity，TIBC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總抗氧化力（total antioxidant activity，T-AOC）、肌酐（creatinine，CR）和尿素氮（urea nitrogen，BUN）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；RNAiso Plus、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、Loading Buffer 日本TaKaRa公司；DNA Marker 華美生物工程公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 上海基康生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ADVIA 2120型全自動血液分析儀 德國西門子公司；Optima 5300DV電感耦合等離子發射光譜儀美國PerkinElmer公司；BX51型顯微鏡 日本Olympus公司；BioPhotometer plus核酸蛋白分析儀 德國Eppendorf公司；DYCP-31CN型瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一生物科技有限公司；Mx3000P實時熒光定量PCR（real-time PCR，qPCR）儀 美國Stratagene公司。

1.3 方法

1.3.1 動物與分組

40 只雄性SD大鼠適應環境7 d后隨機分成對照組（NC組）、鐵超載模型組（Model組）、原花青素組（GSPAs組）、實驗組（Test組）。大鼠自由攝食、飲水。參照文獻[18]的方法，Model組和Test組隔天腹腔注射右旋糖酐鐵（100 mg/kgmb），GSPAs組和Test組大鼠每天灌胃100 mg/kgmb的GSPAs，以生理鹽水消除應激性誤差。10 d實驗期結束后，取大鼠腎臟組織并保存于-80 ℃。

1.3.2 紅細胞、血紅蛋白及TIBC的測定

取大鼠血液測定紅細胞（red blood cell，RBC）數目及血紅蛋白（hemoglobin，Hb）水平，依試劑盒說明書測定TIBC。

1.3.3 腎臟組織Fe含量測定

將濃硝酸與高氯酸以4∶1體積比加入一定量腎臟組織中，搖勻并封口，于室溫下靜置過夜，使其完全消解。次日緩慢低溫加熱進行消化，直到三角瓶中的液體變得澄清透明后停止加熱，冷卻后過濾，以體積分數1%稀硝酸溶液定容之后，通過電感耦合等離子體質譜檢測Fe含量。

1.3.4 腎臟氧化應激狀態的檢測

按照相應試劑盒說明書對GSH-Px、SOD、MDA水平以及T-AOC進行測定。

1.3.5 CR及BUN濃度的測定

根據試劑盒說明書檢測CR及BUN的水平。

1.3.6 腎臟組織HE染色及觀察

參照文獻[19]的方法，按照常規操作對HE染色后的腎臟組織進行組織形態學觀察。

1.3.7 逆轉錄qPCR檢測Fas、Bax基因的表達

將1 mL RNAiso Plus加入至30～50 mg腎臟組織中，充分勻漿后提取RNA。檢測RNA的濃度及純度后，將3 μL的PrimeScriptTMRT Master Mix和一定量的總RNA提取物加入EP管中，并用RNase Free ddH2O加至15 μL（反應液的配制在冰浴上進行），輕柔混合，按照37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃保存的條件進行反轉錄。之后按照95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、62 ℃ 34 s（42 個循環）；95 ℃ 15 s、62.8 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s的條件進行PCR擴增。引物序列為：β-actin：（5’-3’）上游：TACCCAGGCATTGCTGACAG；下游：AGCCACCAATCCACACAGAG。Fas：上游：CGCAGCGGTTAGCTTTTCTG；下游：ATTTGCTCGGCAGCACAAGA。Bax：上游：TGGCGATGAACTGGACAACA；下游：CCCAGTTGAAGTTGCCGTCT。最后用MXPro-MX3000P軟件對數據進行處理。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 16.0軟件，進行方差齊性檢驗之后選用單因素方差分析，再以Tukey法進行均數間的兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義的判定標準。

2 結果與分析

2.1 大鼠RBC數目、Hb含量及TIBC

圖1 GSPAs對鐵超載大鼠RBC數目、Hb質量濃度和TIBC的影響Fig. 1 Effect of GSPAs on RBC content, Hb concentration and TIBC of rats with iron overload

由圖1可見，Model組較NC組，大鼠血液中的RBC、Hb水平升高，TIBC降低；GSPAs組與NC組相比，Hb質量濃度極顯著升高（P＜0.01）。與Model組比較，Test組中的RBC數目、Hb質量濃度顯著降低，TIBC顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 大鼠腎臟組織的鐵含量

圖2 GSPAs對鐵超載大鼠腎臟Fe含量的影響Fig. 2 Effect of GSPAs on renal iron content of rats with iron overload

由圖2可見，相較于NC組，Model組腎臟Fe含量極顯著升高（P＜0.01），GSPAs組Fe含量無明顯變化。與Model組相比較，Test組Fe含量降低，但差異不顯著。

2.3 大鼠腎臟組織氧化應激狀態

圖3 GSPAs對鐵超載大鼠腎臟GSH-Px、SOD活力、MDA含量、T-AOC的影響Fig. 3 Effect of GSPAs on GSH-Px activity, SOD activity, MDA content and T-AOC of kidney tissues in rats with iron overload

由圖3可見，與NC組比較，Model組中的GSH-Px、SOD活力顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），T-AOC差異不顯著，MDA含量顯著升高（P＜0.05）；GSPAs組大鼠GSH-Px、SOD活力和MDA含量差異不顯著，T-AOC極顯著升高（P＜0.01）。與Model組比較，Test組中GSH-Px、SOD活力以及T-AOC顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

2.4 大鼠CR和BUN水平

圖4 GSPAs對鐵超載大鼠CR和BUN濃度的影響Fig. 4 Effect of GSPAs on CR and BUN levels in rats with iron overload

從圖4可見，相比NC組，Model組中的CR和BUN濃度極顯著升高（P＜0.01）；GSPAs組差異不顯著。Test組較Model組CR、BUN濃度極顯著降低（P＜0.01）。

2.5 大鼠腎臟組織形態學變化

HE染色結果（圖5）顯示各組大鼠腎臟無明顯的形態學改變，腎小球和腎小管結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊。

2.6 大鼠腎臟組織Fas和Bax的相對表達量

圖6 GSPAs對鐵超載大鼠腎臟Fas和Bax基因表達的影響Fig. 6 Effect of GSPAs on mRNA expression levels of Fas and Bax in rats with iron overload

由圖6可知，較之NC組，Model組大鼠腎臟組織Fas的表達量顯著升高72.17%（P＜0.05）；GSPAs組中Fas的表達量顯著降低62.94%（P＜0.05）。與Model組進行比較，Test組、GSPAs組中Fas的表達量分別極顯著降低44.98%和78.48%（P＜0.01）。相較于NC組，Model組大鼠腎臟組織Bax表達量顯著上調23.79%（P＜0.05）；GSPAs組中Bax表達量降低30.67%，但差異不顯著。相比Model組，Test組、GSPAs組中Bax的表達量分別極顯著下調23.78%、43.99%（P＜0.01）。

3 討 論

機體的鐵穩態對于細胞活動及生命的維持至關重要，而鐵過量則會對機體產生一系列的損傷作用。本實驗首先通過腹腔注射右旋糖酐鐵的方法構建了鐵超載大鼠模型，并試圖進一步通過補充GSPAs探討其對機體鐵過量的影響。

機體內鐵含量直接關系到Hb的水平和質量[20]。TIBC則可以反映機體中轉鐵蛋白的水平，從而間接反映機體的鐵水平。本研究中大鼠補充過量的鐵后，其RBC、Hb水平顯著升高，TIBC顯著降低。而Test組在補充GSPAs后，以上指標均發生顯著性逆轉。研究發現多酚提取物可調控鐵代謝相關蛋白和轉鐵蛋白受體[21]。Li Changhong等[22]的研究發現多酚可直接清除氧自由基，同時還可螯合鐵離子。結合本課題組前期研究結果[17]，推測本實驗中GSPAs同樣通過其螯合特性拮抗了鐵過量的發生，使體內鐵水平趨于正常。

為了進一步探討GSPAs對于機體鐵水平的影響，選取鐵過量時鐵沉積最為常見的腎組織進行研究。結果發現，在補鐵10 d后，Model組大鼠腎臟組織中鐵含量極顯著升高，而鐵負荷大鼠同時給予GSPAs干預后，其腎臟組織中鐵含量雖無顯著差異，但有下降趨勢。與以上結果保持一致，說明GSPAs通過螯合鐵離子，有降低其在腎臟組織中沉積的作用。

過多的鐵沉積在腎臟處會通過氧化應激產生腎毒性，推動腎病的發生[23]。本實驗發現Model組大鼠腎臟組織發生明顯的氧化應激，而GSPAs可顯著改善這一狀態。研究表明，PAs能直接清除活性氧自由基、螯合金屬離子，進而降低其氧化特性[24]。此外，其能夠誘導內生的抗氧化酶的活性進而發揮間接的抗氧化特性[25]。另有研究發現GSPAs可以提高腎臟組織的抗氧化能力[26]。本研究同樣表明鐵過量導致了腎臟組織的氧化應激，而GSPAs則對鐵超載所致大鼠腎臟氧化損傷具有明顯的拮抗效應。

此外，腎組織的損傷程度可以通過CR、BUN水平以及組織形態學來反映。CR的含量在一定程度上能夠反映腎小球的濾過率，腎臟功能障礙越嚴重，血漿中CR含量越高[27]。同時腎小球濾過功能受損也會導致血漿中的BUN含量增高[28-29]。本實驗中，Model組大鼠CR、BUN含量明顯升高，說明鐵過量引起了大鼠腎臟功能受損，與之前報道結果一致[30-31]。而鐵超載大鼠進行GSPAs干預后，大鼠血清中的CR、BUN濃度極顯著降低，說明GSPAs以其螯合金屬以及抗氧化的特性對由鐵超載而導致的腎臟功能損傷產生了拮抗作用。本實驗進一步從組織形態學觀察鐵超載對腎臟的影響，但是未發現鐵過量大鼠腎臟組織出現病理損傷，推測可能是由于鐵超載的建模時間太短，從而未對腎臟組織造成可見的病理性損傷。GSPAs的補充同樣也未對腎臟組織形態學產生明顯影響。

凋亡是在疾病進程中淘汰有害細胞的一個必需的生理過程，而先前的研究顯示凋亡與氧化應激有著密切的聯系[32]。為了進一步探討GSPAs對于鐵過量所致腎組織損傷的保護作用，進一步探討了其對腎臟組織凋亡的影響。研究表明，Fas和Bax是體內重要的凋亡誘導蛋白[33]。本實驗中發現Model組大鼠腎臟組織中的Fas及Bax基因表達顯著上調，而GSPAs的干預對Fas、Bax基因的表達具有抑制作用。這可能是由于過量的鐵能夠引起氧化應激，從而刺激特定的凋亡途徑，進而啟動細胞凋亡。GSPAs則能夠有效清除自由基，并且螯合部分鐵，從而抑制凋亡相關信號，使得Fas、Bax基因表達下調。

綜上，機體鐵超載可以引起機體鐵含量升高、腎臟氧化應激、肌酐和尿素氮含量升高以及Fas、Bax基因表達的上調，而GSPAs則可通過螯合鐵和抗氧化特性對鐵過量產生的效應進行拮抗，從而對鐵超載所致的腎損傷起到保護作用。