靈芝菌絲體多糖對人皮膚成纖維細胞氧化應激損傷的防護機制

張佳嬋，邵 卿，王 倩，王昌濤,*，趙 丹，李 萌，孫寶國，劉繼濤

（1.北京工商大學理學院，植物資源研究開發北京市重點實驗室，北京 100048；2.北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京 100048；3.北京工商大學食品與健康學院，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048；4.云南白藥集團股份有限公司，云南 昆明 650000）

如今，快節奏的工作生活環境使機體極易處于氧化應激狀態。在正常條件下，機體的酶防御體系發揮著非常重要的作用，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等通過清除多余的自由基來減緩氧化損傷[1]。當活性氧自由基大量產生，其在體內的聚集程度超過機體抗氧化系統自身的清除能力時，則會誘發脂質過氧化反應、DNA損傷以及蛋白質表達異常。因此，氧化應激被認為是衰老的早期階段[2-5]。近年來，人們不斷尋求具有防護氧化應激損傷作用的天然活性成分。

靈芝（Ganoderma lucidum）在中國有悠久的使用歷史，素有“仙草”的美名[6]。在《本草綱目》中有“補中益氣，增智慧，好顏色，久食輕身不老，延年神仙”的描述[7]。靈芝多糖（Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP）是靈芝的重要活性成分之一，已有研究發現GLP在抗氧化功效方面具有出色的表現[8-12]。以往GLP的提取來源多為子實體，因其木質化嚴重、提取率較低。而從靈芝菌絲體中提取多糖的研究，因其較短的周期以及較高的提取效率越來越引起人們的重視[13-15]。與此同時，GLP常因其來源不同而在單糖組成上存在明顯差異[16]。通常高生物活性的GLP大多擁有主鏈長、側鏈變異頻率高、分子質量較大等特點。一般認為，分子質量高于10 kDa的GLP具有較高生物活性，小于此值則活性很低[17]。因此，高活性GLP的篩選及其機制研究則顯得尤為重要。

除了機體自身抗氧化酶系統發揮防護氧化應激的作用機制外，Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）-核因子-E2相關因子（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路被認為是機體最重要的內源性抗氧化信號通路。Keap1-Nrf2/ARE途徑表達的蛋白質分子為機體提供了重要的防御作用，是對抗環境有害物質損傷和內源性應激的有力武器[18-23]。分析該信號通路中重要活性分子的表達水平變化，對于深入分析物質發揮防護氧化應激損傷的內在機制具有非常重要的意義。

鑒于此，本研究以實驗室保存靈芝菌種G055為研究對象，采用常規熱水浸提法[24]對GLP進行工藝條件的優化，并進一步初步純化及分析。同時以H2O2誘導的人皮膚成纖維細胞（human skin fibroblasts，HSF）損傷模型為研究載體，分析GLP及其組分對細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及相關抗氧化酶的作用效果，評價GLP對H2O2誘導的HSF氧化應激的保護及修復功效；最后，以Keap1-Nrf2/ARE信號通路上下游關鍵調控因子為重要考察對象，探究其在mRNA水平的變化。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

靈芝菌種G055來自于實驗室保藏菌種；HSF 中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心；抗壞血酸（純度≥99.7%）國藥集團化學試劑有限公司；0.25%（含乙二胺四乙酸）胰蛋白酶、DMEM培養基、FM培養基、新生牛血清、PBS、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素美國Gibco生命技術公司；EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒、TransStart?Top Green qPCR SuperMix試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；GSH-Px、MDA、SOD、CAT、ROS檢測試劑盒 碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

WJ-80A-II型CO2恒溫培養箱 上海圣科儀器設備有限公司；熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Infinite M200 PRO熒光酶標儀、Sunrise酶標儀 瑞士TECAN公司；SPx-250BF-2生化培養箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；Anke 3-30K臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；1200高效液相色譜儀 美國安捷倫有限公司；DEAE-52陰離子交換層析柱 北京英萊克科技發展有限公司；DHL-A電腦恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GLP提取工藝的確定

將經過活化的G055靈芝液體菌種以體積比1∶10的接種量接種于土豆培養基培養中，置于28 ℃ 180 r/min培養箱中培養7 d。將所得靈芝菌絲體水洗2 遍，冷凍干燥得到靈芝菌絲體凍干粉。取1 g樣品粉末，并按表1條件進行單因素試驗，每組重復3 組，5 000 r/min離心10 min，按照苯酚-硫酸法[25]測定提取液中的多糖含量。根據單因素試驗結果，設計三因素三水平正交試驗（表2），通過正交試驗得到最優提取條件。

表1 單因素試驗條件Table 1 Independent variables and their levels used in one-factor-at-a-time design

表2 三因素三水平正交試驗Table 2 Independent variables and their levels used in orthogonal array design

1.3.2 GLP的初步純化及鑒定

采用Sevag法[26]將熱水浸提后的粗多糖溶液進行脫蛋白處理，具體操作如下：10 g/L的粗多糖溶液以體積比1∶5加入Sevag試劑（氯仿-正丁醇體積比5∶1）中，電磁攪拌30 min后，轉移至分液漏斗中靜置10 min，除去兩相交界處的變性蛋白質。水層取樣測蛋白質量濃度和多糖質量濃度[25]，分別按照公式（1）、（2）計算多糖損失率及蛋白去除率。

采用DEAE-52離子交換柱對脫蛋白后的粗多糖進行初步分離[26]，具體操作如下：取脫蛋白后的GLP配制成10 g/L的多糖溶液，上樣量20 mL。上樣前過0.22 μm孔徑聚醚砜濾膜，除去不溶物。分別用去離子水和0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl以1.0 mL/min的流速分步洗脫，每種洗脫液收集30 管，每管10 mL。用苯酚-硫酸法檢測OD值，作洗脫曲線。合并相同峰組分。透析過夜后在-80 ℃ 0.03 mbar條件下冷凍干燥成粉末。對所得各組分進行純度測定。

采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對各組分進行單糖組成分析測定，具體方法為：稱取2 mg純化后的多糖，加入2 mol/L三氟乙酸5 mL，充氮氣排除空氣，然后120 ℃水解反應4 h，加入無水甲醇，反復旋蒸除去有機溶劑，最后溶于2 mL去離子水中，混勻，取100 μL于新的離心管中，加入氘標記的琥珀酸（10 μL、1.5 g/L）真空冷凍干燥。在凍干樣品中加入20 g/L的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液50 μL，40 ℃水浴反應80 min，反應結束后加入80 μLN-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺，于40 ℃水浴在反應80 min，然后12 000 r/min離心5 min，取上清液放入進樣瓶，室溫放置2 h后，進行GC-MS分析[27]。GC-MS條件：采用HP-5 GC柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進樣量1 μL；分流比為10∶1；進樣口溫度250 ℃；檢測溫度240 ℃；載氣N2，流速1 mL/min；升溫程序為初始溫度110 ℃，保持2 min，8 ℃/min升到160 ℃，再以2 ℃/min升到230 ℃，最后5 ℃/min升到250 ℃，保持2 min。

1.3.3 GLP對HSF細胞抗氧化相關指標的影響

細胞模型的建立：將HSF細胞以孔1×104個/孔接種于96 孔板中，在細胞培養箱中培養過夜，棄去培養基，分別添加100 μL含不同濃度H2O2（1、25、50、100、250、500、1 000 μmol/L）的培養基，各組均設5 個平行，對照組不添加H2O2。刺激1、2、3、4 h后，采用四甲基偶氮唑鹽法[28]，于490 nm波長處測定各孔OD值。得出HSF細胞存活率，選擇細胞存活率為50%的H2O2溶液濃度作為建模濃度，最終確定的建模條件為100 μmol/L H2O2處理細胞2 h。

GLP及其各組分、陽性對照VC處理濃度的確定：將HSF細胞以1×104個/孔接種于96 孔板中，在細胞培養箱中培養過夜。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法[28]，探討不同濃度GLP及其各組分、陽性對照VC對細胞活力的影響（條件參照細胞模型的建立方法，即用100 μL不同濃度樣品替代H2O2，其他條件不變）。選擇細胞存活率為80%以上的樣品濃度作為下一步實驗濃度，結果發現GLP、GLP I、GLP II的質量濃度均為1.25 g/L時，其活力均在80%以上（數據未展示）；陽性對照VC的IC80為86 mg/L（數據未展示）。

GLP及其組分對HSF細胞氧化應激模型的保護和修復：修復組為先加入H2O2刺激2 h后，每孔加入100 μL樣品培養24 h；用無血清DMEM代替樣品處理細胞作為修復作用中的模型組（Model組）。保護組為先加入100 μL樣品培養24 h后，再以H2O2刺激2 h；用無血清DMEM來代替樣品處理細胞作為保護作用中的模型組（Model組）。以無樣品、無H2O2刺激、無血清DMEM處理的細胞為空白組（Control組）。處理結束參照各項指標的試劑盒說明書完成GSH-Px、MDA、SOD、CAT以及ROS水平的測定。

1.3.4 GLP對H2O2誘導的氧化應激模型Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響

根據NCBI中發布的基因序列，通過Primer Express軟件設計引物，以管家基因β-actin作為內參基因，共5 個基因的特異性引物序列見表3。

表3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應引物序列Table 3 Primer sequences used for real-time polymerase chain reaction

1.4 數據統計分析

實驗數據利用SPSS 19.0數據處理軟件進行統計學處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義，所得結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 GLP的提取及純化工藝

2.1.1 GLP的提取工藝優化

固定料液比為1∶50（m/V），浸提溫度為70 ℃，浸提1 次，考察浸提時間對多糖提取率的影響。從圖1A可知，提取時間為1 h時，GLP提取率最高；提取時間在1.5～2.5 h范圍內，提取率無顯著性差異（P＞0.05）；當提取時間延長至3 h時，GLP提取率最低。因此，從節約角度出發，選擇1 h作為最優提取時間。

固定料液比為1∶50（m/V），浸提時間為2 h，浸提1 次，考察浸提溫度對GLP提取率的影響，實驗結果見圖1B?？梢钥闯觯?0 ℃時多糖提取率達到最大，且與其他條件相比差異顯著（P＜0.05），故確定最佳浸提溫度為70 ℃。

固定浸提時間為2 h，浸提溫度為70 ℃，浸提1 次，考察料液比對GLP提取率的影響，實驗結果見圖1C。當料液比為1∶30和1∶60（m/V）時，多糖提取率最高，兩者之間無顯著性差異（P＞0.05），但與其他條件相比顯著提高了GLP提取率（P＜0.05）?？紤]原料成本因素，在該條件下的最優單因素提取條件確定為料液比1∶30（m/V）。

固定料液比為1∶50（m/V），浸提時間為2 h，浸提溫度為70 ℃，考察浸提次數對多糖提取率的影響，實驗結果見圖1D。隨提取次數的增加，多糖提取率大幅下降，第二次提取率僅為（8.05±1.34）%，綜合考慮，選擇浸提次數為1 次。

圖1 不同提取條件對GLP提取率的影響（n＝3）Fig. 1 Effects of different extraction conditions on the extraction yield of GLPs (n = 3)

參照單因素試驗結果，以浸提時間、浸提溫度、料液比為考察因素，以GLP提取率為考察指標，按照表2中的因素設計并進行正交試驗，結果見表4、5。

表4 正交試驗結果分析Table 4 Orthogonal array design with analysis of experimental results

表5 正交試驗方差分析Table 5 Analysis of variance for the effect of various extraction conditions on the extraction yield of GLPs

由表4可知，這3 個因素的最佳組合為A3B1C3。由表5可知，FA＝113.29、FB＝103.19、FC＝68.26，依照影響強度由大到小的順序排列，得到三因素對GLP提取率的影響強弱順序（由強到弱）為A＞B＞C。在最優提取工藝條件（料液比1∶35，m/V），浸提溫度65 ℃，浸提時間1.5 h下進行驗證，得到GLP提取率為（47.70±0.50）%，相對標準偏差為1.04%，再現性良好。利用該方法提取靈芝菌絲體多糖，其提取率遠高于靈芝子實體[29]。這是由于靈芝菌絲體易于破壁，胞內多糖可快速溶出，且靈芝入土生長成為子實體期間自身代謝會消耗多糖，造成多糖總含量的降低[30]。

2.1.2 GLP的純化工藝

通過溶劑提取法所獲的粗多糖通常蛋白質含量較多。用于除去蛋白的傳統方法包括三氯乙酸法、單寧酸法和Sevag法[31-32]。采用三氯乙酸法去除蛋白質的效率很高，但不可避免的是三氯乙酸容易引起多糖的糖苷鍵斷裂，增大多糖損失率。單寧酸法在去除蛋白質過程中多糖的損失率低，可能源于單寧酸與蛋白質間可發生特異性反應，不會破壞到多糖，但其去除蛋白能力不強。Sevag法去除蛋白質的效率最高，也是當前最受歡迎的一種除蛋白的方法[32]。

圖2 Sevag法除蛋白質效果Fig. 2 Removal efficiency of proteins by Sevag regent

本實驗對GLP進行了8 次去蛋白處理，結果如圖2所示。蛋白的脫除率與處理次數呈正相關，首次處理后脫除率僅為（12.31±0.24）%，第8次可達（72.87±1.90）%。當用Sevag處理6 次后，蛋白質的脫除率變化不明顯?？紤]到多糖成分與有機試劑長時間接觸可能會影響其生物活性，因此共進行6 次處理，此時蛋白的脫除率可達（66.68±1.13）%。

圖3 GLP柱層析洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of GLPs by DEAE-52 column chromatography

用DEAE-52離子交換樹脂對脫蛋白后的GLP進行初步分離純化，得到洗脫曲線。由圖3可知，共4 個洗脫峰（I～IV）分別出現在90、390、690、990 mL處，收集合并各組分?？紤]到GLP III和GLP IV吸光度較低，故僅選用第一組分（GLP I）和第二組分（GLP II）進行后續實驗。將收集的組分透析后冷凍干燥，得到GLP I、II。

圖4 GLP（A）、GLP I（B）、GLP II（C）的GC圖譜Fig. 4 GC spectrum of GLPs (A), GLP I (B), and GLP II (C)

表6 單糖相對分子質量及標準曲線Table 6 Monosaccharide molecular masses and standard curves

表7 GLP樣品單糖組成及物質的量比例Table 7 Monosaccharide composition and molar ratio in GLP samples

對GLP及其組分GLP I、GLP II進行衍生反應，利用GC-MS測定單糖組成。圖4為GLP（A）、GLP I（B）、GLP II（C）的GC圖譜。經過與標準品相對分子質量及標準曲線（表6）對比，GLP及其組分的單糖組成及物質的量比例如表7所示。其中GLP I較GLP、GLP II多出鼠李糖和巖藻糖兩種單糖，考慮為純化后的富集作用所引起的。

2.2 GLP對H2O2誘導的氧化應激模型的保護和修復作用

2.2.1 GLP對氧化損傷細胞脂質過氧化產物積累情況的影響

MDA是脂質過氧化的最典型的終產物。MDA含量增加是過氧化作用加劇、細胞脂膜受到損傷的重要表現，其含量越高表明脂質過氧化作用越強[33-34]。圖5A、B分別為保護和修復作用下GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細胞內MDA含量影響的結果。結果表明，100 μmol/L H2O2處理細胞2 h處理后Model組能夠極顯著提高細胞內MDA含量（P＜0.01）。與Model組相比，GLP、GLP I、GLP II、VC均能極顯著減少HSF細胞內MDA的積累（P＜0.01）。在本實驗所考察作用濃度下，各保護作用處理方式中，樣品減少MDA積累的能力由高到低依次為GLP II＞VC＞GLP＞GLP I，修復作用中，樣品降低MDA積累的能力由高到低依次為VC＞GLP II＞GLP＞GLP I，兩種作用中VC與GLP II均不具有顯著性差異（P＞0.05）。

圖5 GLP對HSF細胞內MDA含量的影響Fig. 5 Effect of GLPs on MDA content in HSF cells

2.2.2 GLP對HSF細胞內ROS水平的影響

圖6 GLP對HSF細胞內ROS和MDA積累情況的影響Fig. 6 Effect of GLPs on the levels of MDA and ROS in HSF cells

保護與修復兩種處理方式下GLP及其組分（GLP I和GLP II）與VC對細胞活性氧水平的影響結果如圖6A、B所示。與Control組相比，H2O2處理后極顯著提高了細胞內ROS水平（P＜0.01）?？傮w上看，兩種作用方式下，GLP、GLP I和GLP II均能極顯著降低HSF細胞內ROS的含量（P＜0.01），與陽性對照VC相比，GLP I在保護作用方面具有更為優異的表現。

2.2.3 GLP對氧化損傷細胞抗氧化酶水平的影響

SOD是機體內重要的O2-·清除劑，它可以把有害的O2-·轉化為H2O2，CAT可將H2O2分解為分子氧和水，與SOD具有協同作用，能夠清除體內過剩自由基清除。而GSH-Px是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，三者共同構成了體內的主要抗氧化酶體系，維持機體內部自由基的相對穩定，起到抗氧化的作用。

圖7A1、A2分別為保護和修復兩種方式下，GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細胞內CAT活性影響的結果。與Model組相比，兩種作用方式處理下，GLP、GLP I、GLP II、VC均能極顯著提高HSF細胞內CAT的活力（P＜0.01）；在本實驗所考察作用濃度下，在保護作用處理方式中，各樣品提高CAT的能力由高到低依次為：GLP I＞VC＞GLP＞GLP II，修復作用處理方式中為：GLP I＞GLP II＞VC＞GLP。

圖7B1、B2分別為保護和修復兩種方式下，GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細胞內GSH-Px活力影響的結果。結果表明，兩種作用方式處理下，GLP、GLP I、GLP II與VC均能顯著提高HSF細胞內的GSH-Px活力。在保護作用處理方式下，1.25 g/L GLP I處理HSF細胞24 h再進行H2O2損傷處理，其最終的GSH-Px活力達到（12.19±0.61）U/g，比Model組提高了36.84%；在修復作用處理方式下，GLP I組GSH-Px活力為Model組的7.56 倍，且3 種靈芝多糖處理后的GSH-Px水平均高于陽性對照VC。

圖7C1、C2分別為保護和修復兩種方式下，GLP、GLP I、GLP II與VC對HSF細胞內SOD活力影響的結果。與Control組相比，Model組細胞內SOD活力顯著降低（P＜0.05）。與Model組相比，GLP、GLP I、GLP II和VC均能極顯著提高HSF細胞內SOD活力（P＜0.01）；并且GLP及其兩組分的促進能力均高于陽性對照VC；GLP I的保護和修復能力最高，保護處理方式下，GLP I組SOD活力為Model組的2.39 倍；修復處理方式下，GLP I組的SOD水平為Model的2.92 倍，具有較好的提高SOD活力的能力。

圖7 GLP對HSF細胞內SOD活力的影響Fig. 7 Effects of GLP on SOD activity in HSF cells

2.3 GLP對H2O2誘導的氧化應激模型Keap1-Nrf2/ARE信號通路的影響

Nrf2是細胞抗氧化應激體系中的關鍵信號因子，在細胞質中受到抑制性結合蛋白Keap1控制。Nrf2與Keap1的解離是Nrf2-ARE途徑發揮活性的關鍵步驟。當細胞受到ROS刺激后，Nrf2與Keap1發生解離，活化的Nrf2進入細胞核，在Maf蛋白作用下與抗氧化原件ARE結合，激活靶基因表達，調控下游基因轉錄活性，從而發揮抗氧化損傷作用[35-37]。血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和醌氧化還原酶-1（NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1，NQO1）是該信號通路的下游效應基因編碼的蛋白，HO-1在清除ROS，抵御過氧化物、過氧亞硝酸鹽、羥基和超氧化物自由基方面發揮著重要作用[38]。NQO1可以催化醌還原成氫醌，以促進醌的排泄，阻斷醌參與ROS的產生，減少對DNA的氧化損傷程度。

由前期實驗可知，GLP、GLP I、GLP II的質量濃度均為1.25 g/L時，其活力均在80%以上，因此設定低（0.5 g/L）、中（1.5 g/L）和高（2.5 g/L）3 個劑量來探究GLP對Keap1-Nrf2/ARE信號通路各因子表達水平的影響。

圖8為保護作用處理方式下，不同樣品對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關鍵信號分子的表達情況影響。由圖8A可知，各靈芝多糖（GLP、GLP I和GLP II）處理后，Nrf2mRNA表達量均極顯著高于Model組（P＜0.01），并且顯著高于陽性對照VC組。由圖8B可知，與Model組相比，負調控因子Keap1的相對表達量變化趨勢并不一致，在GLP低劑量組、GLP中劑量組、GLP I中劑量組、GLP II組高劑量組、GLP II組低劑量組中，Keap1表達受到極顯著抑制（P＜0.01），而在其他組中顯著高于Model組；陽性對照VC組的Keap1mRNA相對表達量與Model組相比差異不顯著（P＞0.05）?？赡苁谴嬖谄渌蚝托盘柾吩诎l揮抗氧化作用。

在保護作用研究中，除GLP I中劑量組極顯著降低了下游抗氧化因子HO-1的表達量，其他樣品均能極顯著提高HO-1的表達量（P＜0.01）（圖8C）。GLP中劑量組、高劑量組的NQO1表達提高，且與Model組相比差異極顯著（P＜0.01），GLP I、GLP II組在中劑量組顯著表達（P＜0.05，P＜0.01）（圖8D）。

圖8 保護作用下GLP對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關鍵基因相對表達量的影響Fig. 8 Relative gene expression of key genes in the Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway in cells protected from oxidative stress damage by GLPs

圖9 修復作用下GLP對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關鍵基因相對表達量的影響Fig. 9 Relative gene expression of key genes in the Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway in cells repaired by GLPs against oxidative stress damage

圖9 為修復作用處理方式下，不同樣品對Keap1-Nrf2/ARE信號通路關鍵信號分子的表達情況影響。由圖9A可知，在修復作用中，各靈芝多糖組除高劑量組外，Nrf2的表達量均極顯著提高（P＜0.01）；陽性對照VC修復后，并沒有提高Nrf2的相對表達量，可能原因是細胞受損嚴重，VC的修復作用沒有激活Nrf2的表達。由圖9B可知，負調控因子Keap1在各靈芝多糖處理組中均極顯著低于Model組（P＜0.01）。由圖9C可知，GLP I、GLP II組中HO-1的表達量隨質量濃度的增加先降低后升高，而HO-1僅在GLP低劑量組中極顯著表達（P＜0.01）。由圖9D可知，GLP高劑量組，GLP I、GLP II中劑量組的NQO1極顯著表達（P＜0.01）。

3 討 論

20世紀90年代，有研究者提出了“氧化應激”的概念。當機體處于不利環境時，ROS大量產生，超過人體自身的清除速度，氧化系統和抗氧化系統不平衡，大量的ROS進入細胞參與生化反應，誘發氧化應激。通過破壞DNA，生物體失去了細胞基本生理活動所涉及的基因，導致細胞衰老和組織損傷[4-5]。機體內眾多信號通路在氧化應激過程中起著調節作用。其中，Keap1-Nrf2/ARE信號通路被認為是機體最重要的內源性抗氧化信號通路。Nrf2-ARE途徑表達的蛋白質分子，為機體提供了重要的防御作用，是對抗環境有害物質損傷和內源性應激的有力武器[19-23]。

許多天然活性成分通過參與調節Keap1-Nrf2/ARE信號通路從而達到防護氧化應激損傷的作用效果。白藜蘆醇是一種Nrf2的激活劑，可以通過激活Nrf2-HO-1-NOQ-1和SIRT1-AMPK-PGC-1alpha通路發揮抗炎、對抗氧化應激的作用[39]。Patwardhan等發現秋葵黃酮通過Nrf2-ARE-HO-1防護UVB誘導的人皮膚成纖維細胞的DNA損傷[40]。多糖類成分也被報道具有激活Nrf2因子的作用。從大型褐藻羊棲菜中提取得到的多糖可以通過JNK1-β2-NRF2的相互作用激活Nrf2/ARE信號通路，并啟動Nrf2下游相關抗氧化和解毒酶基因的表達，進而提高機體整體的抗氧化能力，最終延緩小鼠的衰老進程[41]。此外，有文獻也報道了在防護氧化應激損傷方面具有顯著效果的其他植物多糖，如杏鮑菇多糖[42]、膠秋藻多糖[43]、枸杞多糖[44]、銀耳多糖[44]等。靈芝作為一種名貴中草藥，在中國已有了2 000多年的應用歷史。靈芝多糖作為靈芝的一種重要活性成分，在抗氧化、抗衰老方面的研究已深入開展。邱玉芳等[46]報道了靈芝多糖可以上調血清中SOD水平。此外，周婕[47]和陳玉勝[48]等研究發現靈芝多糖除了可以清除羥自由基、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、超氧陰離子自由基以及過氧化氫外，還可以通過減輕脂質過氧化從而保護因輻照所造成的肝損傷。在本研究中，來源于菌種wG055的靈芝多糖GLP及其組分GLP I和GLP II同樣具有顯著的防護氧化應激損傷的功效。在保護和修復兩種處理方式上，GLP及其組分顯著降低了HSF損傷細胞MDA的積累和ROS水平，與文獻[47]報道相符；并且，GLP可以顯著提高細胞抗氧化酶的水平，對Keap1-Nrf2/ARE關鍵信號因子具有顯著的調節作用，進一步解釋了其發揮防護氧化應激方面的作用機制。

本實驗為GLP在食品、藥品領域的應用提供了一定的理論參考。但是，在機制研究方面可能還不全面，盡管Keap1-Nrf2/ARE信號通路是一條重要的內源性抗氧化信號通路，但是機體的內在平衡是多因子、多信號通路復雜調控的結果。后期可以借助組學技術對GLP的深層機制進行更系統、更全面的分析，闡明GLP發揮作用的深層機制。