益氣化瘀方聯合干細胞移植促進脊髓損傷修復的實驗研究※

●周瑞娟 盧曉惠 張秋萍 陳海鵬 徐 浩 劉書芬 徐樂勤▲

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴重的中樞神經系統損傷，全球范圍每年平均每百萬人口中約有10.4～83人發生SCI[1]。該疾病可導致嚴重的運動、感覺和自主神經功能障礙，給患者日常生活帶來極大的痛苦，同時也給家庭和社會帶來沉重的負擔。細胞移植是目前神經再生領域研究熱點之一，也是最有希望治愈SCI的方法之一[2]。當前可用于移植的細胞種類有誘導性多潛能干細胞（induced pluripotent stem cells，IPS）、神經干細胞、間充質干細胞、胚胎干細胞、嗅鞘細胞、雪旺細胞等[2-3]。本課題組前期實驗表明，過表達Mash-1基因可促進胚胎干細胞（CE3小鼠胚胎干細胞）在體外[4]和脊髓損傷部位向神經細胞分化[5]。在實驗中，本課題組也觀察到移植細胞在脊髓損傷部位的存活數量較少。文獻報道，移植細胞的存活數量多少與脊髓損傷的炎癥環境密切相關[6]。

在既往的研究中，本課題組觀察到益氣化瘀方可減輕慢性脊髓損傷的炎癥反應[7]；促進背根節細胞表達BDNF[8]，抑制caspase-3和bax的表達[9-10]，進而減少背根節細胞的凋亡。由此可見，益氣化瘀方具有改善炎癥反應，促進周圍神經損傷修復的作用。因此，本實驗擬在前期研究基礎上，進一步觀察益氣化瘀方聯合移植過表達Mash-1基因的胚胎干細胞對脊髓損傷的修復作用。

1 材料與方法

1.1 動物KM種小鼠60只，雄性，無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級，6～8周齡，體重（20±2）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

1.2 試劑DMEM、L-gul、β-mercaptoethanol、胰酶（GIBCO公司，美國）；FBS（BIOCHROM公司，英國）；LIF細胞因子（CHEMICON公司，美國）；nestin抗體、β-tubulin III抗體（Abcam公司，英國）；熒光二抗（KPL公司，美國）；逆轉錄試劑盒、熒光素酶（TAKARA公司，日本）。益氣化瘀湯劑由上海中醫藥大學附屬龍華醫院提供（組成：黃芪15g，黨參12g，丹參9g，川芎9g，人工麝香0.03g。煎煮濃度為1g生藥/mL）。

1.3 細胞懸液的制備按前期的實驗方法培養Mash-1基因修飾的小鼠胚胎干細胞（CE3-Mash-1細胞）[5]。細胞移植注射前，采用0.125%胰酶消化，終止后吹打成單個細胞懸液，離心，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2次，通過計數板計數確定細胞總數，然后用生理鹽水重懸細胞，調整細胞濃度為5×104個/μL備用，移植前將細胞懸液置于冰上保存。

1.4 小鼠急性脊髓損傷模型建立、分組及治療給藥小鼠購買后適應性喂養3天。按體重隨機分為假手術組、模型組、益氣化瘀方組（以下簡稱中藥組）、Mash-1修飾胚胎干細胞移植組（以下簡稱干細胞組）、益氣化瘀方聯合Mash-1修飾胚胎干細胞移植組（以下簡稱聯合組）。假手術組只暴露脊髓不予Dumont 5號鑷夾持損傷脊髓。其余各組按Plemel JR報道[11]的方法建立急性脊髓損傷模型，具體步驟如下：采用氯胺酮腹腔注射麻醉小鼠（給藥劑量0.05mL/10g體重），麻醉后將小鼠固定于俯臥位，逐層暴露T13節段脊髓，隨后采用Dumont 5號鑷從前后方向夾持脊髓15s，無菌紗布輕輕壓迫止血，逐層縫合。術后第1天，采用小鼠后肢運動功能（Basso mouse scale，BMS）評分[8]驗證模型是否成功。所有動物術后連續3天給予腹腔注射50,000U/kg的青霉素；擠壓膀胱輔助排尿至自身排尿反射恢復。

術后第3天，根據小鼠體重，采用氯胺酮麻醉小鼠，固定于俯臥位，碘伏常規消毒，拆除背部的縫線，直接暴露損傷的脊髓節段。暴露完成后，干細胞組及聯合組用10μL的微量進樣器抽取之前準備好的細胞懸液，移植的細胞數目為1×105個，即2μL的細胞懸液，注射到脊髓損傷部位中心，垂直進針，進針深度為1.5mm，以緩慢的速度注射，注射后留針2min；假手術組、模型組、中藥組給予注射2μL生理鹽水。

待小鼠蘇醒后，中藥組、聯合組給予益氣化瘀湯劑（0.1mL/10g體重）灌胃；假手術組、模型組、干細胞組給予等體積生理鹽水灌胃。每天灌胃1次，連續給藥4周。各組小鼠分別于建模后的1、7、14、21、28天進行BMS評分。

1.5 脊髓標本的取材與固定分別于脊髓損傷建模后的14和28天，采用10%水合氯醛麻醉，每組處死6只小鼠。其中，3只小鼠的脊髓標本放置于4%多聚甲醛中固定，另3只小鼠脊髓標本放置于液氮中保存，擇期抽提總RNA。小鼠脊髓標本經4%多聚甲醛固定16h后倒去固定液，清水沖洗2h后，將標本放置于15%和25%蔗糖溶液中各脫水24h，最后去除蔗糖溶液，經OCT膠包埋，冰凍切片機將小鼠脊髓切成5μm厚度組織切片，用防脫載玻片粘取組織。切片完成后放置于室溫通風1天，晾干切片，裝入切片盒中，放置-20℃冰箱保存。

1.6 HE染色從-20℃冰箱取出切片，室溫放置10min；將切片放置于清水中5min；蘇木素2min；清水沖洗；0.04%的鹽酸酒精分化5s；清水沖洗；2%氨水返藍10min；清水沖洗；伊紅2min；清水沖洗；85%、95%、100%梯度乙醇各2min；二甲苯I、二甲苯II、二甲苯III各2min；中性樹膠封片；60℃烤箱烘烤過夜；Olympus相差顯微鏡采片。

1.7 免疫熒光染色從-20℃冰箱中取出切片，放置于PBS中浸泡5min，取出切片放置于濕盒中，用紙巾擦除組織周圍的水分，蛋白酶K消化10min（修復抗原），PBS洗2min×3次，0.5%PBST通透20min，PBS洗2min×3次，加入5%BSA封閉20min，加一抗OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP（1：500稀釋），4℃過夜。37℃恒溫箱孵育1h，PBS洗5min×3次，紅色熒光標記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1h，PBS洗5min×3次，加入1μg/mL的DAPI室溫避光孵育10min，PBS洗2min×3次，熒光顯微鏡下采片。陰性對照用PBS代替一抗。

1.8 RNA抽提及real-time PCR從液氮中取出脊髓組織，用分析天平秤取100mg脊髓組織，用去酶的眼科剪將脊髓組織剪碎，加入1mL TRIZOL，常規抽提總RNA，經紫外分光光度計測定RNA的純度和濃度后，采用TAKARA逆轉錄試劑盒按試劑盒實驗步驟將RNA轉錄成cDNA，隨后進行實時熒光定量PCR檢測BDNF、CNTF、NGF、NT3、IL-1、IL-6、TNF-α、MIP2、caspase-3、bax、bcl-2及β-actin的基因表達情況。

根據GenBank檢索目的基因序列設計引物，采用primer 5軟件設計擴增引物序列，由華大基因公司合成引物序列。各基因名稱和序列見表1。PCR結果采用ΔCt法進行分析（Ct為循環閾值）和2-ΔΔCt表示各組間各基因的表達差異。

表1 神經營養因子、炎癥因子和凋亡相關基因名稱和引物序列

1.9 統計方法應用SPSS 20.0統計分析軟件處理數據，計量資料數據均以表示。先對各組數值變量進行正態性分析，不符合正態分布的數據采用非參數檢驗。符合正態分布的數據，進一步檢驗方差齊性。方差齊時兩組間數據比較采用獨立樣本t檢驗，多組數據間的比較采用單因素方差分析LSD-t法檢驗。方差不齊時，組間數據比較采用非參數Mann-Whitney U檢驗。

2 結果

2.1 功能評分術后第1天，假手術組的小鼠后肢的運動功能均為正常，評分值為9分；造模后各造模組的小鼠后肢出現明顯運動功能障礙，評分均為0。術后第7天，即細胞注射和給藥后第4天，干細胞組和聯合組的小鼠后肢運動功能有部分恢復，與模型組和中藥組比較均具有統計學差異（P＜0.05）。在造模后的第14、21和28天，干細胞組和聯合組的小鼠后肢運動功能進一步恢復，與模型組和中藥組比較均具有統計學差異（P＜0.01）。在造模后第21和28天時，聯合組小鼠后肢運動功能明顯優于單純細胞移植的干細胞組，比較具有統計學差異（P＜0.05或P＜0.01）。中藥組小鼠的后肢運動功能評分略高于模型組，但無明顯的統計學差異（P＞0.05）。見圖1、表2。

圖1 術后第28天各組小鼠的后肢運動功能照片

表2 BMS評分（分，）

表2 BMS評分（分，）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與中藥組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與干細胞組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01

2.2 脊髓橫切面HE染色從脊髓橫切面HE染色可見，在造模后的14天和28天時，模型組和中藥組小鼠的脊髓橫切面剩余面積明顯減少，與假手術組比較存在統計學差異（P＜0.01）。干細胞組和聯合組的小鼠脊髓剩余面積均有明顯的恢復，與模型組和中藥組比較具有統計學差異（P＜0.01）。假手術組、干細胞組和聯合組三組間的脊髓剩余面積無明顯差異（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 造模后14d和28d時各組脊髓橫切面HE染色圖

表3 脊髓橫切面剩余面積（μm2，）

表3 脊髓橫切面剩余面積（μm2，）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與中藥組比較，▲▲P＜0.01

2.3 免疫熒光結果由于CE3胚胎干細胞帶有GFP，因此可在熒光顯微鏡下通過綠色熒光跟蹤移植細胞在體內的存活數量和所在位置，進一步通過帶紅色熒光的二抗與不同的一抗結合可觀察到移植的細胞在體內的存活和分化情況。免疫熒光染色結果顯示，干細胞組與聯合組的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四種細胞標記蛋白的陽性細胞比例無明顯差別，見圖3和表4。但在造模后的第28天，聯合組的細胞存活數目明顯多于干細胞組。見圖4、表5。

圖3 術后第14d和28d，脊髓組織免疫熒光染色圖

表4 移植細胞在損傷脊髓部位的分化情況（%，）

表4 移植細胞在損傷脊髓部位的分化情況（%，）

注：兩各細胞移植組的OCT3/4、nestin、β-tubulin III、GFAP四種細胞標記蛋白的陽性細胞比例無明顯差別（P＞0.05）

圖4 造模28d后干細胞組和聯合組的移植細胞在脊髓損傷部位的存活情況圖

表5 造模14和28d后兩組移植細胞的存活數量（個，）

表5 造模14和28d后兩組移植細胞的存活數量（個，）

注：與干細胞組比較，##P＜0.01

2.4 基因表達改變情況本實驗主要檢測各組小鼠損傷脊髓的神經營養因子(BDNF、CNTF、NGF、NT-3)、炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2)和凋亡相關基因(caspase-3、bax、bcl-2)的表達情況。在造模14天時，模型組的炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相關基因caspase-3的表達明顯增高；中藥組的炎癥因子IL-1、TNF-α 和凋亡相關基因caspase-3的表達相對模型組減少，同時神經營養因子BDNF的表達略微升高；干細胞組和聯合組小鼠的炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相關基因caspase-3的表達明顯降低，同時神經營養因子的BDNF、CNTF、NGF、NT-3表達均有升高。此時，干細胞組和聯合組在以上幾種基因的表達無明顯差別（見圖5 A）。在脊髓損傷28天時，模型組小鼠脊髓的炎癥因子TNF-α和神經營養因子BDNF、NT-3的表達相對假手術組均有升高；中藥組的炎癥因子TNF-α表達相對模型組降低，同時略微增加神經營養因子BDNF的表達；干細胞組小鼠的炎癥因子TNF-α和神經營養因子BDNF、CNTF、NT-3的表達均升高；而聯合組的神經營養因子BDNF、CNTF、NT-3的表達上升，且相對模型組和干細胞組其炎癥因子TNF-α表達明顯下降（見圖5 B）。

3 討論

益氣化瘀方能輕微改善小鼠脊髓損傷后的神經功能，可能通過減少炎癥因子IL-1、TNF-α 和凋亡相關基因caspase-3的表達，促進神經營養因子BDNF、NT-3的表達，進而減輕脊髓的繼發性損傷。文獻報道，益氣化瘀方可以減輕慢性脊髓損傷和椎間盤退變引起的炎癥反應[7,12]。在之前的實驗中，益氣化瘀方可減少的背根節神經細胞[9]和椎間盤纖維環細胞[13-14]、軟骨細胞[15]表達caspase-3和bax基因。本研究表明，益氣化瘀方聯合干細胞移植能顯著保留脊髓的橫切面剩余面積，減少炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α、MIP-2和凋亡相關基因caspase-3的表達，同時增加神經營養因子的BDNF、CNTF、NGF、NT-3表達，增加移植細胞在損傷脊髓部位的存活，進而提高小鼠后肢運動功能。

圖5 造模后14 d和28d各組神經營養因子、炎癥因子和凋亡相關基因的表達情況圖

益氣化瘀方由黃芪、黨參、川芎、丹參、人工麝香組成。方中重用黃芪，其味甘，性微溫，入脾、肺，具有補中益氣、利水消腫之功，可大補脾胃之元氣，使氣旺血行、瘀去絡通而為君。黨參補中益氣，健脾益肺為臣，與黃芪合用以增強健脾益氣之功。川芎辛、溫，行氣開郁、活血止痛，善行血中之氣；丹參活血化瘀、行氣止痛，配合川芎則有行氣活血、祛瘀生新之效，共為佐藥。使以麝香辛香走竄,活血通絡、散瘀止痛，以助黃芪、丹參行氣化瘀之功。全方共奏益氣化瘀通絡之效。

脊髓損傷后炎癥因子的表達明顯上升，實驗研究表明通過減輕脊髓損傷后的炎癥反應具有一定的治療作用。中藥黃芪、丹參和川芎均具有提高SOD活性，減少繼發性損傷，促進神經功能恢復[16-18]。而且，中藥有效組分麝香提取物、丹參酮IIA和黃芪總苷對神經損傷后的多條信號通路進行調節，進而起到提高神經元存活、促進軸突再生、抑制細胞凋亡和抗炎等作用[19-22]。神經營養因子主要由少突膠質細胞和星形膠質細胞分泌，具有營養神經元、促進軸突生長等作用。文獻報道，中藥復方（痙證方[23]、補陽還五湯[24]、活血通督湯[[25]、通竅活血湯[26]、桃紅四物湯[27]）、單味中藥（黃芪[28-29]、丹參[16]）和中藥有效組分（川芎嗪[30]、麝香酮[31]）具有促進神經營養因子NGF、BDNF、CNTF和NT-3的基因表達。脊髓損傷后的凋亡相關基因高表達，引起神經細胞凋亡也是導致脊髓神經功能障礙的主要原因之一。活血通督湯[32]、補陽還五湯[33]、活血醒腦方[34]、血府逐瘀湯[35]等活血化瘀復方均具有減少神經凋亡的作用。黃芪配伍丹參或配伍川芎可減少大鼠出血或缺血模型的腦細胞凋亡[36-37]。在中藥單體方面，丹酚酸B[38]和川芎嗪[39-40]能調節自噬、氧化應激反應，減少脊髓損傷后caspase-3的表達，保護線粒體，從而減少神經細胞凋亡。現代藥理還表明黃芪、丹參、黨參和川芎可以保護血管內皮、調節血流狀態、改善局部微循環、清除氧自由基、減輕脂質過氧化損害，并具有一定的調節免疫、抗炎鎮痛的作用[18,41-44]。脊髓損傷后，上述中藥一方面可以通過減輕炎癥反應、清除自由基、調節免疫等保護正常的神經元和髓鞘，另一方面可以通過改善損傷微環境、增加血供，為存活的神經細胞提供營養物質，為移植細胞提供有利的微環境，增加移植細胞的存活，從而促進軸突和髓鞘的再生，最終達到促進脊髓神經功能修復的作用。