Oleosin蛋白和磷脂酰膽堿相互作用對重組油體乳液穩定性的影響

孫禹凡,謝鳳英,鐘明明,齊寶坤,2,3,*,李 楊,2,3,*

(1.東北農業大學食品學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.哈爾濱市食品產業研究院,黑龍江 哈爾濱 150028;3.國家大豆工程技術研究中心,黑龍江 哈爾濱 150086)

油體是植物種子中用來貯存油脂的細胞器,是由磷脂及油體結合蛋白包裹液態甘油三酯形成的球體結構,直徑通常為0.5～2.5 μm。其中,Oleosin蛋白(OL)是油體結合蛋白的主要成分且含量最為豐富(占油體結合蛋白的80%～90%),是一類疏水、堿性小分子蛋白,分子質量通常為16～24 kDa[1]。Tzen等[2]深入研究發現OL分子含有3 個區域,其中央疏水區由兩列反向排列的β-折疊的氨基酸殘基插入油相中,形成發卡狀構型。對天然油體環境穩定性起著關鍵作用[3]。然而,正是由于這種穩定結構的存在,使得天然油體較難封裝天然疏水性化合物,限制了其應用領域。因此,人們開始模擬天然油體結構,建造類似于天然油體穩定結構的重組油體乳液,用于裝載營養素(如姜黃素類)和藥物(用于持續釋放喜樹堿,一種疏水性抗癌藥物)等[4]。

1992年Tzen[5]通過混合甘油三酯、三亞油酸甘油酯和磷脂酰膽堿(phosphatidyl choline,PC),以及分別從小麥、水稻、油菜籽和大豆分離的OL,首次成功地制備了物理穩定良好的重組油體乳液。此后科學家試圖拓展其應用領域,裝載不同的功能成分。目前,研究者利用重組油體乳液進行功能性物質的包封和運載。Chiang等[6-7]分別利用OL、油脂和磷脂自組裝油體靶向遞送疏水性藥物,并利用石斑魚吸收模型對重組油體的封裝效果和緩釋進行了研究,也證明了采用重組油體可將90%以上功能成分封裝,并且延長了功能性成分的釋放曲線。Vargo等[8]將重組油體與磁性氧化鐵融合,成功構建出一種磁性納米材料,并成功負載藥物,精確地靶向配體達到靶向治療的效果。此外,油體乳液穩定不易被氧化的特點也漸漸吸引人們的眼球,Wijesundera等[9]利用金槍魚油、菜籽中提取的OL和磷脂模仿天然油體來制備重組油體,從而形成含有高度不飽和脂肪酸的物理和氧化穩定的食品乳液。目前,對于重組油體乳液的構建及應用研究相對較多,但OL與磷脂間的相互作用對重組油體乳液功能性質的研究較少,且OL與磷脂間的比例對構建重組油體穩定性的影響研究也鮮有報道。

本實驗研究不同組分質量分數的OL與磷脂中主要成分PC相互作用對重組油體乳液穩定性的影響。以天然油體中主要成分甘油三酯、PC和OL為原料,利用超聲處理構建重組油體,探究重組油體中關鍵組分互作模式,建立重組油體結構與界面模型,評價其穩定性與界面特性,為穩定乳液的構建及包埋功能性物質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆(東農36號)由東北農業大學大豆研究所提供;蔗糖 天津科密歐化學試劑有限公司;大豆油為市售一級大豆油;異辛烷 天津市富宇精細化工有限公司;異丙醇、丁醇、甲醇、氯仿、丙酮、氫氧化鈉 天津市天力化學試劑有限公司;試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

KC-701超微粉碎機 北京開創同和科技發展有限公司;UP-400S超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;UV-2600/2700紫外-可見分光光度計 島津企業管理(中國)有限公司;F-4500型熒光分光光度計日立高新技術公司;Nano-ZS90粒度分析儀、Bohlin-CVO流變儀 英國馬爾文公司;PHSJ-4A型實驗室pH計中國上海雷磁公司;分析天平(0.000 1 g) 北京賽多利斯儀器系統有限公司;FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司;IX71奧林巴斯倒置顯微鏡 上海豫光儀器有限公司;TNZ1-5700傅里葉紅外光譜儀 英國Thermo Fisher公司;OCA20視頻接觸角測量儀 德國Data Physics儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OL的提取

參考Deleu等[10]的方法提取OL,并做適當修改。將大豆和水以料液比1∶5(g/mL)浸泡,在4～6 ℃條件下放置18～20 h。用組織搗碎機以18 000 r/min 磨漿90 s,用四層脫脂紗布過濾除去豆渣,并收集濾液。將濾液中加入質量分數4%氯化鈉,冰水浴攪拌15 min,轉移到離心管中,在4 ℃條件下,19 000 r/min 離心30 min,收集上層乳狀物,并重復此步驟2 次,最后用去離子水清洗;將處理后的上層乳狀液用0.22 μm的濾膜過濾,將過膜處理后的乳狀液與3 倍體積的乙醚混合后,以5 000 r/min離心15 min除去中性脂質,該過程重復3 次。將獲得的殘渣再用氯仿-甲醇-去離子水(4∶2∶1,V/V)混合后,以5 000 r/min離心15 min,收集中間白色膠體;并與3 倍體積的冰丙酮混合,以5 000 r/min離心15 min,收集沉淀即為OL。最后將OL置于氮氣下以除去剩余的有機溶劑,冷凍干燥后用于進一步分析。

1.3.2 OL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)

參考Surewicz等[11]的實驗方法稍作修改。SDS-PAGE分離膠質量分數為15%,濃縮膠質量分數為5%。將OL溶于水配制成質量濃度為3 μg/mL的溶液,取樣品加上樣緩沖液煮沸5 min。上樣量15 μL,在80 V條件下運行30 min,進入分離膠后增至120 V。采用考馬斯亮藍溶液進行凝膠染色后進行脫色。

1.3.3 重組油體乳液構建

在pH 7.4下構建重組油體乳液。使用OL、PC和大豆油構建重組油體,具體添加量如表1所示。為保障OL和PC混合均勻,在室溫下不斷攪拌2 h。然后將錐形瓶置于冰水浴中1 h,將超聲波處理器的鈦探頭(直徑0.636 cm)插入液面下,距離錐形瓶底部1 cm處,在20 kHz條件下,輸出功率200 W處理6 min,超聲時間4 s,間隔時間2 s,并每5 min向冰水浴中加入冰塊保持低溫。

表1 重組油體乳液中不同組分質量分數Table 1 Percentages of various components in reconstituted emulsions%

1.3.4 乳化活性及乳化穩定性測定

乳化性的測定參考Li Chen等[12]方法。將均質的乳狀液用0.1% SDS溶液稀釋100 倍,在500 nm波長處用紫外分光光度計測定吸光度,按式(1)計算乳化活性指數(emulsifying activity index,EAI)。靜置30 min后測定吸光度,按式(2)計算乳化穩定性(emulsion stability index,ESI)。

式中:N為稀釋倍數(100);C為乳化液形成前乳化劑質量濃度(g/mL);φ為乳化液中油相體積分數/%;A0為第0分鐘時的吸光度;A10為第10分鐘時的吸光度;T10-T0為時間差(10 min)。

1.3.5 接觸角測定

使用接觸角分析儀在25 ℃通過座滴的方法測定。乳液涂抹于載玻片制備成直徑為13 mm且厚度為2 mm的薄膜。使用高精度注射器將一滴水(5 μL)沉積在薄膜的表面上。在通過攝像機從注射器下落之后立即記錄液滴圖像,并且液滴的輪廓被數值求解并且適合于Laplace-Young方程,可確定其界面張力。每個樣品在3 個顆粒中的每個上測量接觸角,并對每個顆粒進行3 次測量[13]。

1.3.6 貯藏穩定性測定

參考Saeidy等[14]方法稍作修改。取新鮮乳液至10 mL透明玻璃瓶中,封口密閉,置于室溫,避光貯存每隔7 d觀察,上層為乳析層,下層為清液層。乳析指數(creaming index,CI)計算如下:

式中:Hc為下層清液高度/cm;Ht為整個乳化液的高度/cm。

1.3.7 Zeta電位、粒徑的測定

采用Malvern Zetasizer Nano ZS電位及粒度分布儀測定乳液的Zeta電位。利用Malvern Mastersizer 2000激光粒度儀測定乳液的液滴直徑。稀釋乳液的倍數約為1∶1 000。乳液液滴的平均粒徑采用體積平均直徑(D4,3)表示。所有的測試均在25 ℃條件下進行,平行測定3 次。

1.3.8 濁度測定

將不同組分質量分數的重組油體乳液分別用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液溶液稀釋100 倍后,以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液為空白對照,用紫外分光光度計測定600 nm波長處的吸光度,濁度計算如下:

式中:A為稀釋乳液在600 nm波長處的吸光度;V為稀釋倍數;I為光程差0.01 m。

1.3.9 微觀結構的測定

利用配有DP27型顯微數碼相機的奧林巴斯BX53型生物顯微鏡對重組油體乳液的顯微結構進行觀察。用0.01 mol/L pH 7.4的磷酸緩沖溶液將樣品稀釋10 倍,用吸管取2～3 滴稀釋后的重組油體乳液于干凈干燥的載玻片上,輕輕的加上蓋玻片后,置于顯微鏡明場放大20 倍進行觀察。

1.3.10 內源熒光光譜的測定

應用F-4500熒光分光光度計測定樣品的熒光光譜[15]。將超聲處理后的樣品稀釋,使其質量濃度達到0.15 mg/mL。光譜測定條件設置為激發波長287.5 nm,掃描波長300～500 nm,激發狹縫5 nm,發射狹縫寬5 nm。重復掃描3 次。

1.3.11 三維熒光光譜的測定

采用熒光光譜儀并參考Li Yang等[16]方法測定不同OL/PC比例下構建重組油體的三維熒光光譜,將制備好的重組油體乳液稀釋50 倍后,取一定量置于比色皿中測定得到三維熒光結構圖。初始激發波長為280 nm,掃描波長為200～500 nm,譜帶寬度10 nm,掃描16 條曲線。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 OL的SDS-PAGE

圖1OL的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE of oleosin

圖1 表明,采用Nikiforidis等[17]方法所提取的OL除去了油體表面大部分的其他結合蛋白,其中24 kDa被認為是OL,通過凝膠成像儀表明OL質量分數高達95.6%,滿足實驗純度要求。

2.2 乳化性分析

圖2 不同OL/PC質量比對重組油體乳化特性的影響Fig. 2 Effects of OL/PC ratio on EAI and ESI

由圖2可知,與單獨添加磷脂或蛋白相比,OL-PC相互作用制備乳液可明顯提高其乳化特性。并且,隨著磷脂添加量的增加,重組油體乳液的乳化性呈先升高后降低的趨勢。當OL/PC=1.5時,重組油體的EAI和ESI均最高,分別為33.11 m2/g、74.22 min,較單獨添加磷脂形成的乳液分別提高2.87、7.65 倍。這可能是由于PC與OL發生疏水相互作用,從而改變OL表面活性,并對其結構和表面電荷進行修飾,隨著PC添加量的增加甚至可能將OL完全包裹至PC形成的膠束和囊泡中。此外,二者相互作用可在乳液油-水界面均勻分散,降低重組油體乳液的界面張力,從而改變其乳化特性。然而,當蛋白比例持續增加(OL/PC＞1.5)時,重組油體乳液的乳化性又有所下降,與Torrezan等[18]研究結果相似,這是因為當溶液中添加過量的OL時,OL與PC在油-水界面處發生競爭吸附的現象,乳液中的PC分子被替換下來,從而導致乳化能力降低。

2.3 接觸角分析

圖3 不同OL/PC質量下重組油體乳液的接觸角Fig. 3 Effects of OL/PC ratio on contact angle

圖4 不同OL/PC質量下重組油體乳液乳液界面張力Fig. 4 Effects of OL/PC ratio on dynamic interfacial tension

接觸角是指在氣、液、固三相交點處所作的氣-液界面的切線,此切線在液體一方,與固-液交界線之間的夾角為θ,是潤濕程度的量度[19]。從圖3觀察得知,與單獨添加蛋白相比,向重組油體乳液中添加PC時,接觸角均有所下降,結果表明接觸角的改變主要受PC添加量的影響,可能是由于親水性磷脂吸附在乳液的表面增加了乳液的親水性。當OL/PC=1.5時,接觸角降至最小值(25.7°),說明此時重組油體乳液親水性最強,OL-PC結合效果最佳,而OL/PC＞1.5時,接觸角又所上升,當添加過量的OL時,OL與PC在油-水界面處發生競爭吸附的現象,在油-水界面處OL占據了主導地位。另一方面,Yu Long等[20]研究表明,乳液的穩定性與界面張力和界面壓的大小有著密切相關,界面張力越小,界面壓越大,乳液越穩定。

由圖4得知,OL/PC=1.5時界面張力值也是最小的,說明OL/PC=1.5時所形成的重組油體乳液最穩定。猜測由于在此濃度下OL與PC結合度最高,OL-PC復合物吸附在重組油體乳液的油-水界面,在增加了乳液的親水性的同時又起到良好的穩定劑的作用。

2.4 貯藏穩定性分析

圖5 不同OL/PC質量比對重組油體貯藏穩定性的影響Fig. 5 Effects of OL/PC ratio on storage stability

不同OL/PC質量比例下形成的重組油體乳液貯藏穩定性如圖5所示。乳層析指數表征的是乳液抵抗重力分層的能力,單獨添加PC時,樣品在室溫條件下放置24 h內即出現相分離現象,這可能由于乳液表面的組成物質單核含量較低,乳液液滴之間未能提供足夠的排斥力阻止乳層析現象的發生[21]。除此之外,Nur Hanani等[22]研究發現,乳化劑的組成成分也是影響乳層析指數的重要因素。重組油體乳液主要是由OL、PC和油脂組成,其中OL在油-水界面上作為主要成分阻止乳液重力分層,也可與PC發生疏水相互作用形成更為致密的乳化層,使乳液在幾天之內保持相對穩定。因此,與單獨添加PC時相比,OL-PC乳液顯示連續穩定的狀態,原因可能是乳化劑的組成成分中OL柔性結構舒張與PC對接后復合體系的構象發生改變而提高兩者之間的相互作用。當蛋白質含量過少時,乳化效果較差;蛋白質含量過高時,則高濃度的OL與PC出現競爭吸附,乳液的穩定性由此受到影響。當OL/PC=1.5時,乳液顯示出最低的乳層析指數21.5%,說明此時乳液的穩定性最好。

2.5 平均粒徑、粒徑分布、Zeta電位及濁度分析

超聲處理后乳液液滴的破碎與重聚同時發生,但粒徑D4,3的測量可迅速捕捉液滴平均粒徑的變化,不同OL/PC質量比重組油體乳液的平均粒徑和粒徑分布變化如圖6A、B所示。當單獨添加OL時重組油體乳液的粒徑最大為3 703 nm,相反單獨添加磷脂時乳液得到最小粒徑為490 nm,這是由于磷脂本身為小分子乳化劑,具有較小的分子質量[23]。隨著PC含量的增加,重組油體乳液的平均粒徑呈現先降低后增加的趨勢,OL/PC=1.5時,粒徑為810.4 nm,且粒徑分布圖從多峰變成單峰,說明乳液呈現均一穩定的狀態。Magnusson等[24]研究發現磷脂的添加對乳狀液的乳析動力學和粒子密度產生影響,粒徑減小與界面層電荷增加有關,可阻止乳液發生絮凝和聚沉。然而,當OL/PC＞1.5,乳液的平均粒徑逐漸增加。當OL/PC=50時,D4,3達到2 114 nm,且粒徑分布呈現多峰趨勢,這可能是隨著蛋白含量的增加,導致油-水界面上的磷脂分子被替換,OL與PC之間的相互作用減弱,不足以維持重組油體以小液滴的形式存在,所以粒徑有所上升,這與Crespo-Villanueva等[25]研究結果一致。

圖6 不同OL/PC質量比對重組油體乳液平均粒徑（A）、粒徑分布（B）、Zeta電位（C）和濁度（D）的影響Fig. 6 Effects of OL/PC ratio on mean particle size (A), droplet size distribution (B), zeta-potential (C) and turbidity (D) of reconstituted emulsion

由圖6C可知,與未添加PC相比,單獨添加OL時重組油體乳液呈現最低的靜電荷11.4 mV,并隨著PC含量的增加,Zeta電位絕對值均有不同程度的增加,說明添加PC后可以增加乳液的電負性,這可能是由于OL與PC發生疏水相互作用,使蛋白結構發生改變氨基酸結構暴露,使重組油體乳液帶有更多的負電荷。當OL/PC=1.5時,重組油體乳液Zeta電位的絕對值最大為46.1 mV,說明此時乳液液滴表面的同種電荷含量較高,彼此間的靜電斥力保證乳液在貯存期間發生液滴擾動效應,因此穩定性較強[26]。該結果與2.3節中樣品乳化穩定性結論一致。

乳液的濁度也可以表現乳液的穩定性。有研究表明當油相體積分數固定,乳液粒徑是影響濁度的主要因素,二者呈正相關,乳滴平均粒徑越大,體系濁度越高[27],本實驗濁度與粒徑變化結果保持一致。由圖6D可知,當OL/PC＞1.5時,濁度隨OL質量分數的增加而增加,這是可能是油水界面處蛋白含量達到飽和,連續相中未被吸附蛋白含量增加,最終導致重組油體乳液濁度的增加。

2.6 光學顯微鏡分析

圖7 不同OL/PC質量比對重組油體微觀結構的影響Fig. 7 Effect of OL/PC ratio on microstructure of recombinant oil body

由圖7可知,PC=0和OL=0時乳化體系中乳滴分布較為不均,且乳滴大小不均一,有少量乳滴發生輕微聚集現象,這可能是由于乳液中乳滴較大促進了絮凝現象的產生。而當OL/PC=1.5時,相對于其他樣品乳液液滴大小較為均一,且分布均勻,因此乳液乳化穩定性較強,這與之前乳化穩定性測定結果相似,其微觀結構與粒徑分布趨勢一致。

2.7 內源熒光光譜分析

如圖8所示,經超聲處理后的OL最大發射波長為310 nm。由此可知本實驗所測試OL殘基分布趨向蛋白分子外部環境[28]。OL的內源熒光主要來源于Trp殘基,PC與OL結合使Trp殘基的微環境發生改變,從而OL的熒光強度發生改變。由圖8可知,隨著PC的不斷加入,雖然OL的熒光光譜的峰形不變,但OL的內源熒光強度逐漸降低,λmax紅移2.0 nm,表明PC對OL的內源熒光產生了強烈的猝滅作用,PC與OL發生相互作用可使OL的空間構象發生改變,進而使Trp殘基微環境發生改變,由疏水環境轉變為親水環境。同時表明熒光猝滅是因小分子與熒光物質相互作用而使其熒光強度下降的現象。該結果與2.5節中粒徑、Zeta電位中的推測結果一致。

圖8 不同PC添加量對OL熒光光譜的影響Fig. 8 Effect of different amount of added PC on OL fluorescence spectrum

2.8 三維熒光光譜分析

圖9 不同PC添加量對OL三維熒光光譜的影響Fig. 9 Effect of different amounts of added PC on three-dimensional fluorescence spectrum of OL

三維熒光在二維的基礎上增加了測量的維數,更加便于直觀觀測熒光強度狀態的變化,增加了光譜的分辨率[29]。OL和PC之間的相互作用很大程度上影響OL的理化性質,從而對OL-PC所形成的重組油體乳液產生影響,因此使用三維熒光進行研究。圖9顯示,在添加不同PC時對OL三維熒光光譜的影響,實驗組前期研究證明OL的激發波長和發射波長都在220 nm處,證明其發色基團主要出現在此波長下;當OL與PC相互結合時在激發波長200～500 nm范圍內,出現第2個峰,證明二者發生相互作用[16]。實驗數據顯示,當OL/PC=1.5時,熒光強度較其他樣品明顯下降,這可能是由于在該條件下OL中多肽鏈發生解折疊,OL中的發色基團被埋在復合物的疏水區域中發生熒光猝滅效應,暫時無法被識別,導致熒光強度明顯降低[30]。這也表明當OL/PC=1.5時,二者結合程度最大,更有利于重組油體乳液的形成,與上述其他研究結果一致。

3 結 論

OL-PC復合乳化體系的乳化活性、乳化穩定性等功能性質,因OL與PC比例的不同而具有差異性。當OL/PC=1.5時,重組油體乳液的乳化活性和乳化穩定性最高。乳液分散均勻、界面張力及接觸角最小,并通過熒光光譜分析得出此時二者結合程度最大。

通過界面特性分析得出,當添加過量的OL時,OL與PC在油-水界面處發生競爭吸附的現象,在油-水界面處OL占據了主導地位導致乳化能力及穩定性的降低。而當OL/PC=1.5時,OL會促進與PC的相互作用,在油-水界面上形成較穩定的界面膜,利于重組油體的穩定。

OL-PC的添加比對重組油體乳液會產生一定的影響。適量添加OL會明顯改善重組油體乳液的乳化及貯藏穩定性,這將為穩定乳液的構建提供理論基礎。