基于Label-free技術的漢麻籽不同發芽時期蛋白質組學分析

董 艷,張正海,王 寧,孫宇峰,*,魏連會,宋淑敏,姬妍茹,楊慶麗,石 杰,田 媛

(1.黑龍江省科學院大慶分院,黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江省八一農墾大學,黑龍江 大慶 163319)

漢麻籽又稱工業大麻籽或火麻籽,屬于四氫大麻酚含量低于0.3%的大麻科、大麻屬一年生草本植物大麻的果實[1]。自古以來漢麻籽一直是食品、油脂以及精神藥物的重要來源[2],也被用于中藥預防便秘[3]、降低膽固醇[4]、免疫調節[5]、抗衰老[6]、改善記憶[7]等。漢麻籽不僅含有β-谷甾醇、生育三烯酚、木質酰胺等生物活性成分,也是良好的蛋白質來源,非常適合人類和動物食用[8-9],但因其質地堅硬、不易煮熟的特點,制約了加工利用。目前,發芽萌動的方法己廣泛用于南瓜籽、蘿卜籽、亞麻籽等改善加工特性和適口性、提高其營養價值并降低抗營養因子的含量等方面[10-12]。近年來,有關漢麻籽發芽的研究己有報道,Werz等[13]認為漢麻籽發芽既不會誘導大麻素的形成,也不會改變不飽和脂肪酸的有益特征,但可以誘導產生抗炎化合物。Frassinetti等[14]對漢麻籽發芽0、3、5 d的抗氧化作用進行了評價,發現漢麻籽發芽后總多酚、類黃酮和黃酮醇含量提高,抗氧化能力增強。但迄今為止,漢麻籽發芽過程的分子機制仍鮮有研究,蛋白質組學的發展,為研究漢麻籽萌發過程中不同時期蛋白質的差異和功能提供了有效手段。本研究以自然發芽0、12、24、36、48 h的漢麻籽為研究對象,利用非標記(Label-free)定量技術和液相色譜-串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技術構建出漢麻籽發芽過程中的表達譜,對比發芽前后漢麻籽蛋白質組學的變化,并對各時間點鑒定出的差異蛋白進行生物學分析,研究其基因本體(gene ontology,GO)富集功能和KEGG代謝通路,旨在更好地了解漢麻籽發芽不同時期的功能蛋白,為優化漢麻籽營養水平給于一定參考,為進步一開發漢麻籽萌動食品提供理論數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻1號漢麻籽采自黑龍江省科學院大慶分院東風農場,使其自然萌發,萌發時間分別為12、24、36、48 h;二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT) 比利時Acros Organics公司;BCA定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;三羥甲基氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)飽和酚 美國Promega公司;胰蛋白酶、Tris-HCl、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS) 美國Sigma公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Q-Exactive質譜儀、EASY-n1000高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)儀 賽默飛世爾科技有限公司;5430R低溫高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質提取和肽段酶解

參考曹曉林等[15]報道的酚提取法對樣品總蛋白提取,冷凍干燥后,采用SDT(0.04 mg/mL SDS,1 mmol DTT,溶解于pH 7.6的Tris-HCl)溶液裂解[16],超聲破碎,離心后取上清液,經0.22 μm濾膜過濾,BCA定量試劑盒對樣品定量。各組樣品采用超濾輔助樣品制備法進行胰蛋白酶酶解[17],通過C18Cartridge固相萃取柱對酶解肽段脫鹽,凍干后加入40 μL體積分數0.1%甲酸溶液復溶,測定280 nm波長處的OD值,對肽段定量[18]。

1.3.2 LC-MS/MS條件及數據分析

參考董飛等[19]方法,樣品酶解后,采用納升級液相系統EASY-nLC1000進行LC-MS/MS分析。

色譜柱:賽默飛EASY column SC200(RP-C18,150 μm×100 mm);流動相:A為0.1%甲酸-2%乙腈溶液,B為0.1%甲酸-84%乙腈溶液;色譜柱以100%的A液平衡,樣品依次經上樣柱和分析柱分離,流速為300 nL/min;梯度洗脫:0～85 min,100%～55%A,0%～45% B;85～87 min,55%～0% A,45%～100% B;87～90 min,100% B。

酶解產物經毛細管HPLC分離后用Q-Exactive質譜儀進行ESI質譜鑒定[20]。分析時長60 min;檢測方式:正離子;母離子掃描范圍:m/z 300～1 800;一級質譜分辨率:70 000@ m/z 200;二級質譜分辨率:17 500@ m/z 200;多肽和多肽碎片的質荷比按照下列方法采集:每次全掃描后采集20 個碎片圖譜,得到LC-MS/MS原始數據,再用Maxquant軟件查庫鑒定并進行Lable-free定量分析[21]。

1.4 生物信息學分析

將未萌發的漢麻籽作為比較組,通過差異倍數大于1.5作為篩選標準得到差異蛋白,采用Omicsbean軟件和R verision 3.5.0軟件對目標蛋白進行GO功能注釋、KEGG通路注釋和蛋白聚類分析,生成層次聚類熱圖,基于STRING(http://string-db.org/)數據庫中的信息查找蛋白之間的直接和間接相互作用關系,生成相互作用網絡圖。

2 結果與分析

2.1 差異表達蛋白質的鑒定及統計分析結果

按照表達倍數變化1.5 倍以上的標準篩選差異表達蛋白質,表達倍數變化大于1.5 倍表現為上調,表達倍數變化小于0.67 倍表現為下調。由此篩選出差異蛋白質的結果如表1所示,漢麻籽發芽12、24、36、48 h與原點相比分別鑒定出差異蛋白86、106、135、158 種,其中發芽48 h后上調蛋白質數量為103,占差異蛋白質總數的65.2%。

表1 差異蛋白質分析結果統計Table 1 Statistics results of differential protein analysis

2.2 差異表達蛋白質聚類分析

利用R version 3.5.0軟件分析發芽漢麻籽差異蛋白集合的定量信息,同時對樣品和蛋白質的表達量2 個維度進行分類,根據層次聚類算法對4 個時間點的差異表達蛋白質分別進行聚類分析。如圖1所示,顯著性上調蛋白質主要是蛋白/S10、短鏈脫氫/還原酶、果糖二磷酸醛縮酶(酶代碼EC4.1.2.13)、11-S種子貯藏蛋白等,顯著性下調蛋白質主要為豆莢蛋白、IQ基序、非特征蛋白質、新生多肽相關復合物α亞單位等。

圖1 差異表達蛋白質聚類分析結果Fig. 1 Clustering analysis of differentially expressed proteins

2.3 差異表達蛋白質標準化分類體系功能富集分析

差異表達蛋白質標準化分類體系,它從生物過程、細胞組分和分子功能3 個角度對蛋白質功能進行分類[22]。利用蛋白質組學分析軟件對鑒定的所有蛋白質進行標準化分類體系功能注釋,如圖2所示。4 組比較組中,參與的生物學過程主要涉及代謝過程、細胞過程、單一生物過程,說明發芽過程對漢麻籽細胞內蛋白質的代謝影響很大。細胞組分主要分布在細胞、細胞組分、細胞器、大分子復合物、細胞器組分,差異倍數最高的為乙醛酸循環體,差異倍數為8。乙醛酸循環是油料植物種子脂類代謝的重要途徑,在發芽過程中脂肪酸經乙醛酸循環產生琥珀酸,后者經三羧酸循環進入糖異生途徑轉化為葡萄糖,為種子萌發提供更多的能量[23]。差異表達基因的分子功能主要包括催化活性和結合,此外發芽48 h與三羧酸循環相關的琥珀酰輔酶A連接酶活性、檸檬酸合成酶活性、異檸檬酸脫氫酶活性以及糖酵解中的關鍵酶6-磷酸果糖激酶活性均為原點的7 倍。

圖2 功能富集分析Fig. 2 Functional enrichment analysis

2.4 差異表達蛋白質代謝和信號轉導通路富集分析

圖3 通路富集分析Fig. 3 Pathway enrichment analysis

常用代謝和信號轉導通路研究數據庫分析差異表達蛋白質代謝和信號轉導通路富集[24-26]。如圖3A所示,通過費希爾精確檢驗方法對比較組12 h-原點的差異表達蛋白質進行代謝和信號轉導通路富集分析,結果顯示,氨基酸的生物合成、碳代謝、代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、2-氧羧酸代謝、糖酵解/糖異生等重要通路發生了顯著變化。如圖3B所示,24 h-原點的差異表達蛋白質中氨基酸的生物合成、碳代謝、代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、三羧酸循環、蛋白酶體和2-氧羧酸代謝等重要通路發生了顯著變化。如圖3C所示,36 h-原點的差異表達蛋白質中碳代謝、氨基酸的生物合成、代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、光合作用-天線蛋白、蛋白酶體、糖酵解/糖異生和核糖體等重要通路發生了顯著變化。如圖3D所示,48 h-原點的差異表達蛋白質中碳代謝、三羧酸循環、氨基酸的生物合成、代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝和2-氧羧酸代謝等重要通路發生了顯著變化。

2.5 蛋白質相互作用網絡分析

基于蛋白質相互作用數據庫中的信息查找目標蛋白質之間的直接和間接相互作用關系,生成相互作用網絡并對網絡進行分析。在生物體中,蛋白質并不是獨立存在的,其功能的行使必須借助于蛋白質間的相互作用調節和介導[27]。因此,研究蛋白質相互作用形成的網絡,對不同發芽時間與原點探索蛋白質發揮功能的分子機制具有重要意義。如圖4所示,通路節點為差異蛋白所屬的標準化分類體系/代謝和信號轉導條目,顏色由黃色漸變為藍色,P值隨之增大。與蛋白關聯的線條數量越多,表明該蛋白在網絡中越關鍵,漢麻籽不同發芽時間的差異蛋白彼此間及與互作網絡數據庫收錄的其他蛋白間聯系緊密,主要相關通路為核糖體、碳代謝、三羧酸循環、光合生物的固碳作用、氨基酸的生物合成和糖酵解/糖異生等。

圖4 差異表達蛋白質相互作用網絡圖Fig. 4 Differentially expressed protein interaction network diagram

3 結 論

漢麻籽發芽時蛋白質的變化非常復雜,是影響和提高其營養價值的重要因素[27]。在酶的作用下,蛋白質水解為多肽和氨基酸,這些產物又參與分解代謝或合成新的氨基酸,從而使蛋白質和氨基酸含量發生變化[28-30]。本實驗基于Label-free技術和LC-MS/MS技術分析漢麻籽在不同發芽時期的差異表達蛋白質,并對分離鑒定出來的差異蛋白質進行蛋白質聚類分析、標準化分類體系注釋和代謝和信號轉導注釋的富集分析以及蛋白質相互作用網絡分析。實驗共鑒定到蛋白質為485 個,由蛋白質層次聚類分析熱圖可以看出,本實驗得到的差異蛋白質信息合理;經代謝和信號轉導功能注釋分類和代謝和信號轉導注釋的富集分析后,可以看出多數蛋白質與碳代謝及氨基酸的生物合成有關。由蛋白質相互作用網絡分析可以得到全面系統的分子層面的細胞活動模型,以便于今后對分子機制進行深入研究。由于漢麻籽的基因組十分龐大,目前還存在許多未知的基因組鑒定尚未完成,所以漢麻籽的蛋白質組學研究將成為探索其萌發機制的重要途徑。本實驗利用蛋白組學手段確定了漢麻籽中的部分蛋白質,并完成了漢麻籽部分自身萌發的相關代謝通路及蛋白質的差異表達,這為漢麻籽后期在食品、藥品等方面的工業化發展提供了有效的參數。