控制桃果實采后病害拮抗酵母的篩選及其固體制劑的制備

張曉云,閆雪莉,吳 鋒,顧香玉,趙利娜,張世濤,張紅印,*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇 鎮江 212013;2.江蘇科技大學糧食學院,江蘇 鎮江 212004;3.江蘇益群農業科技有限公司,江蘇 新沂 221400)

桃甜美多汁、營養價值高,但在貯藏和運輸過程中極易受到病原菌侵染而發生病害。由匍枝根霉(Rhizopus stolonifer)引起的軟腐病是桃果實采后主要病害之一,發病的果實會喪失可食用性,造成巨大的經濟損失[1]。因此必須采取有效的措施控制桃果實采后病害。傳統的物理控制法存在對設備要求較高、影響果蔬品質等缺點,而化學控制法易引起病原菌抗性、殘留的化學殺菌劑對消費者健康造成危害等[2-3]。近年來,利用拮抗微生物控制果蔬采后病害逐漸成為研究的熱點,并有望成為替代化學殺菌劑的新方法[4-5]。其中拮抗酵母因其自身諸多優點而受到廣泛的關注[6]。因此利用拮抗酵母控制桃果實采后病害具有廣闊的應用前景。

拮抗酵母制劑化是其實際應用的前提和基礎。但目前,我國無商品化的拮抗酵母制劑,國際上也只有少數幾種拮抗酵母制劑產品上市。雖然拮抗酵母液體制劑的制備相對簡單,但其運輸和保存較為困難,因此制備拮抗酵母的固體制劑對其應用尤為重要。噴霧干燥法是一種將溶液、乳液或懸浮液快速干燥成固態產品的方法,具有干燥速率快、時間短(一般為15～40 s)、工藝簡單和可連續化生產等優點[7-8]。與其他干燥方式如低溫冷凍干燥法相比,噴霧干燥法具有更高的干燥效率和更快的干燥速率,干燥的產品脫水徹底、質量輕、便于運輸和貯藏,且低溫冷凍干燥費用比噴霧干燥高6～10 倍[9]。噴霧干燥過程中,可以利用保護劑包覆活性微生物(如酵母菌、乳酸菌等),使微生物本體與外界環境隔離,增強其抵抗氧、熱等不良刺激的能力,從而提高微生物的存活率[10],所制備的固體制劑一般能在低溫或常溫條件下保存較長時間[11]。

本研究從實驗室分離保存的4 株酵母菌中篩選對桃果實采后軟腐病具有控制作用的拮抗酵母菌,進一步考察拮抗酵母對桃果實自然腐爛的控制效果及其對桃果實品質的影響;然后通過單因素試驗考察噴霧干燥過程中所用保護劑種類、阿拉伯膠和海藻糖比、保護劑質量濃度、霧化壓強、進風溫度和進料速率對固體制劑中拮抗酵母活菌數的影響,從而優化噴霧干燥的條件,并測定所制備的固體制劑在25 ℃和4 ℃保存過程中拮抗酵母的存活率以及保存90 d的固體制劑對桃果實采后軟腐病的控制效果,為制備可用于控制桃果實采后病害的拮抗酵母制劑提供參考,對加快拮抗酵母的實際應用進程具有促進作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用白鳳水蜜桃(Prunus persica (L.) Batsch cv.Baifeng)采摘于江蘇省鎮江市有機果園中桃樹向陽部位,挑選外觀良好、大小均一、無器械損傷、果實表面粉紅色、八成熟的桃果實作為實驗材料。果實用清水沖洗后,以體積分數0.2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min,再次沖洗,自然晾干后備用。

阿拉伯膠、麥芽糊精、β-環糊精均為分析純;海藻糖、酪蛋白酸鈉、脫脂乳粉均為食品級。

NYDA培養基:酵母浸膏5 g,牛肉浸膏8 g,葡萄糖10 g,瓊脂15 g,溶于1 000 mL水;NYDB培養基:NYDA培養基不加瓊脂;PDA培養基:稱取切碎的馬鈴薯200 g于適量水中煮沸20 min,8 層紗布過濾,濾液加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂粉,加水至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養箱 上海一恒科技有限公司;大型噴霧干燥機 常州市魯騰公司;恒流蠕動泵 常州維西爾公司;5810R多功能臺式離心機 艾本德中國有限公司;生物顯微鏡 麥克奧迪公司;HYL-C3組合式搖床 太倉市強樂實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 酵母懸浮液的制備

1.3.1.1 新鮮酵母懸浮液

實驗室分離的酵母菌Pichia occidentalis、Debaryomyces hansenii、P. anomala、P. membranaefaciens于NYDA培養基上28 ℃培養2 d。分別挑取2 環于裝有50 mL NYDB培養基的三角瓶(250 mL)中,28 ℃、180 r/min振蕩培養20 h;培養液于8 000 r/min離心15 min,棄上清液。沉淀以無菌生理鹽水洗滌2 次并重懸,用血球計數板計數并調至濃度為1×108cells/mL備用。

1.3.1.2 固體制劑懸浮液

稱取適量經噴霧干燥獲得的固體制劑,于50 mL 0.85%生理鹽水中,28 ℃、180 r/min振蕩至均勻懸浮,血球板計數并調整酵母濃度至1×108cells/mL。

1.3.2 病原菌孢子懸浮液的制備

R. stolonifer分離于自然腐爛的桃果實,接種至PDA培養基上,25 ℃培養5～7 d后,挑取適量孢子于10 mL離心管中,振蕩混勻,用血球計數板計數并調整濃度至5×104spores/mL。

1.3.3 酵母菌對桃果實采后軟腐病的抑制

用無菌打孔器在桃果實腰部等距離刺出3 個傷口(5 mm深、3 mm寬),每個傷口加入30 μL新鮮酵母懸浮液,以等體積的無菌生理鹽水作為對照。2 h后在傷口處加入30 μLR. stolonifer孢子懸浮液,待桃果實放置2 h后擺放至己消毒的塑料筐(47 cm×35 cm×12 cm)內,保鮮膜密封,貯藏于恒溫恒濕培養箱內(20 ℃、相對濕度95%),分別于第60小時和第72小時記錄果實腐爛直徑和發病果實數目,并計算果實腐爛率。每個處理包含12 個果實,3 次重復。腐爛率的計算式如下:

1.3.4 酵母菌對桃果實采后品質影響及自然腐爛抑制

采摘的桃果實當天運回實驗室,對果實逐一噴灑新鮮P. membranaefaciens懸浮液,以覆蓋整個果實表面為標準,對照組(CK)噴灑相同體積的無菌生理鹽水。噴灑后的果實置于消毒塑料筐內,室溫放置2 h,然后轉移至恒溫恒濕培養箱內(20 ℃、相對濕度95%),貯藏8 d后,計算桃果實的自然腐爛率及測定品質相關指標。每個處理3 個平行,每個平行12 個桃果實,實驗重復2 次。

桃果實品質相關指標測定方法如下:硬度參考邵秀芝等[12]的方法,采用TA-XT質構分析儀對桃果實果實的硬度進行測定;可溶性固形物采用手持式糖度計進行測定[13];可滴定酸度采用酸堿滴定法[14],測定結果以酒石酸百分比表示,每個處理重復4 次;VC含量采用氫氧化鈉滴定法[14],每個處理重復4 次。

桃果實質量損失率和自然腐爛率按式(2)、(3)計算:

1.3.5P. membranaefaciens固體制劑的制備

1.3.5.1 噴霧干燥流程

將離心收集的菌體與保護劑溶液混合,使菌體質量濃度達到50 g/L,28 ℃、180 r/min振蕩混勻45 min。設置噴霧干燥機參數,待出風溫度達到80 ℃時,打開空氣壓縮機,調整蠕動泵進料速率后開始進行噴霧干燥,結束后測定所得固體制劑中酵母活菌數并換算成對數值。進料前及結束后分別用適量無菌水進樣,以沖洗干燥機內殘渣。

1.3.5.2 保護劑的篩選

根據表1,分別稱取一定量的阿拉伯膠、脫脂乳粉和酪蛋白酸鈉于裝有適量0.85%生理鹽水的三角瓶中,50 ℃水浴攪拌至完全溶解,再等比例加入其他保護劑,制備總質量濃度為100 g/L的保護劑溶液。然后按照1.3.5.1節方法進行噴霧干燥,以每克干粉中活菌數的對數值作為指標選取合適的保護劑。

表1 保護劑種類的篩選Table 1 Screening of protectants

1.3.5.3 阿拉伯膠與海藻糖比對固體制劑中活菌數的影響

按照1.3.5.2節的方法,分別制備阿拉伯膠與海藻糖質量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3的保護劑溶液。在霧化器壓強200 kPa、進風溫度120 ℃、進料速率20 mL/min條件下,按1.3.5.1節方法進行噴霧干燥。

1.3.5.4 保護劑質量濃度對固體制劑中活菌數的影響

按1.3.5.2節的方法分別制備總質量濃度為60、80、100、120、140 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液。在霧化器壓強200 kPa、進風溫度120 ℃、進料速率20 mL/min條件下,按1.3.5.1節方法進行噴霧干燥。

1.3.5.5 霧化器壓強對固體制劑中活菌數的影響

按1.3.5.2節的方法制備總質量濃度為100 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液,設置噴霧干燥機霧化器壓強分別為100、150、200、250、300 kPa,進風溫度為120 ℃、進料速率為20 mL/min,按照1.3.5.1節方法進行噴霧干燥。

1.3.5.6 進風溫度對固體制劑中活菌數的影響

按1.3.5.2節的方法制備總質量濃度為100 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液,設置噴霧干燥機進風溫度分別為90、100、110、120、130 ℃,霧化器壓強為200 kPa,進料速率為20 mL/min,按1.3.5.1節方法進行噴霧干燥。

1.3.5.7 進料速率對固體制劑中活菌數的影響

按1.3.5.2節的方法制備總質量濃度為100 g/L的阿拉伯膠與海藻糖(1∶1)溶液,將蠕動泵進料速率分別設置為10、15、20、25、30 mL/min,進風溫度為100 ℃、霧化器壓強為200 kPa,按1.3.5.1節方法進行噴霧干燥。

1.3.6 固體制劑相關指標的測定

1.3.6.1 活菌數的測定

準確稱取1 g噴霧干燥獲得的固體制劑,溶于50 mL無菌0.85%生理鹽水中,28 ℃、180 r/min振蕩至均勻懸浮,梯度稀釋后,分別吸取各梯度稀釋液100 μL均勻涂布于NYDA培養基上,28 ℃培養2 d,計數活菌數并換算成lg(CFU/g)固體制劑。

1.3.6.2 水分含量的測定

稱取3 g左右噴霧干燥獲得的固體制劑于干燥至質量恒定的鋁制稱量盤中,在105 ℃烘箱內干燥至質量恒定(前后2 次稱質量誤差小于2 mg)后立即轉移至干燥器內,待溫度降至室溫后稱質量[13]。每個處理3 次平行,實驗重復2 次。水分含量按下式計算:

式中:ma為空稱量盤質量/g;mb為干燥前稱量盤和干粉的總質量/g;mc為干燥后稱量盤和干粉的總質量/g。

1.3.6.3 保存期間酵母菌存活率的測定

固體制劑置于無菌、干燥的50 mL離心管中,分別于25 ℃和4 ℃條件下密封保存。每30 d取樣測定活菌數,計算固體制劑中的酵母存活率。每個處理3 次平行,實驗重復2 次。酵母菌存活率按下式計算:

式中:C1為保存一定時間的單位固體制劑的活菌數/CFU;C2為保存前單位固體制劑的初始活菌數/CFU。

1.3.7 固體制劑對桃果實軟腐病的控制效果

按1.3.3節處理桃果實,傷口處分別接種30 μL新鮮制備的酵母懸浮液、于25 ℃以及4 ℃條件下保存90 d的固體制劑懸浮液,并以等體積的無菌生理鹽水和保護劑溶液代替拮抗酵母懸浮液分別作為陰性(CK)和陽性對照,其他操作同1.3.3節。3 d后統計腐爛率。

1.4 數據處理

采用SPSS軟件對數據進行分析和處理。實驗數據不低于3 個時,采用ANOVA進行方差分析,Duncan多重比較進行差異分析,P＜0.05,差異顯著。

2 結果與分析

2.1 拮抗酵母的篩選

拮抗酵母對水果采后病害的控制效果與其在水果上與病原菌競爭空間和營養的能力、對病原菌上的直接寄生作用、對宿主抗病性的誘導能力等相關[15],因此不同拮抗酵母對果蔬水果采后病害的控制效果不同。秦國政等[16]利用P. membranaefaciensHansen控制“綠化3號”桃果實軟腐病,在桃果實傷口處接種酵母菌懸浮液4 h后,再接種較低量R. stolonifer孢子懸浮液(15 μL,5×104spores/mL),72 h后桃果實腐爛率近20%,顯著低于對照(約為60%)。而林麗等[17]在“大久保”桃果實傷口處接種Cryptococcus laurentii懸浮液4 h后,再接種低量R. stolonifer孢子懸浮液(20 μL,1×104spores/mL),7 d后桃果實腐爛率(23.3%)顯著低于對照(93.3%)。本實驗中,將4 株酵母菌接種在白鳳水蜜桃傷口處2 h后,再接種較高量R. stolonifer孢子懸浮液(30 μL,5×104spores/mL),桃果實的腐爛率和腐爛直徑如圖1、2所示。由圖1可知,60 h后,P. occidentalis和D. hansenii處理的桃果實腐爛率與對照組(71.31%)沒有顯著性差異(P＞0.05),而P. anomala和P. membranaefaciens處理的桃果實腐爛率顯著低于對照組,尤其是P. membranaefaciens處理的桃果實腐爛率僅為20.10%。72 h后,4 株酵母菌處理的桃果實腐爛率均顯著低于對照組(95.70%),其中P. membranaefaciens處理的桃果實腐爛率仍然最低(26.23%)。從圖2可以看出,4 株酵母菌處理對桃果實腐爛直徑的影響結果與腐爛率相似。因此,后續以菌株P. membranaefaciens作為研究對象,開展進一步的研究。

圖1 4 株酵母菌對桃果實軟腐病腐爛率的影響Fig. 1 Effect of four yeast strains on the decay incidence of peaches caused by Rhizopus rot

圖2 4 株酵母菌對桃果實軟腐病腐爛直徑的影響Fig. 2 Effect of four yeast strains on the lesion diameter of peaches caused by Rhizopus rot

2.2 新鮮P. membranaefaciens懸浮液對桃果實采后自然腐爛及貯藏品質的影響

由表2可以看出,在20 ℃條件下貯藏8 d,相比于對照組,酵母處理的桃果實自然腐爛率顯著降低(P＜0.05),且品質相關指標(如質量損失率、硬度和可溶性固形物等)與對照組相比均無顯著性差異(P＞0.05)。該結果表明,P. membranaefaciens能顯著抑制采后桃果實的自然腐爛,并對桃果實的品質無顯著不良影響。

表2 新鮮P. membranaefaciens懸浮液對桃果實采后自然腐爛率和品質指標的影響Table 2 Effects of fresh P. membranaefaciens suspension on natural decay incidence and quality indicators of peach fruit

2.3 P. membranaefaciens固體制劑的制備

2.3.1 保護劑的篩選

噴霧干燥過程中,選擇適當的保護劑可降低噴霧干燥對菌體的損害,提高酵母菌存活率[18]。如圖3所示,在第1組實驗中,阿拉伯膠單獨作為保護劑,制劑中P. membranaefaciens活菌數顯著低于其與β-環糊精、麥芽糊精、海藻糖作為復合保護劑時的活菌數。其中阿拉伯膠與海藻糖作為復合保護劑時活菌數最高,為8.1(lg(CFU/g))。第2組和第3組實驗結果與第1組類似,組內活菌數最高的保護劑分別是脫脂乳粉與海藻糖、酪蛋白酸鈉與海藻糖。可見加入海藻糖作為保護劑對提高固體制劑中P. membranaefaciens活菌數具有顯著作用,這可能與海藻糖能和微生物細胞膜組分形成氫鍵,取代水的位置,從而提高細胞膜的穩定性有關[19]。3 組實驗中,阿拉伯膠與海藻糖作為復合保護劑時,制劑中酵母菌活菌數最高。因此,后續實驗選擇阿拉伯膠和海藻糖作為復合保護劑。

圖3 保護劑種類對固體制劑中酵母活菌數的影響Fig. 3 Effect of protectants on the number of viable cells in solid preparation

2.3.2 阿拉伯膠與海藻糖質量比對固體制劑酵母活菌數的影響

在噴霧干燥時,不同保護劑的配比對微生物的抗逆性也有一定的影響[20-22],因此考察阿拉伯膠與海藻糖質量比對固體制劑中P. membranaefaciens活菌數的影響至關重要。由圖4可知,隨著海藻糖所占比例的增加,固體制劑活菌數先升高后降低,當阿拉伯膠與海藻糖質量比為1∶1時活菌數最高,為8.07(lg(CFU/g))。因此后續實驗選擇阿拉伯膠與海藻糖質量比為1∶1作為復合保護劑。

圖4 阿拉伯膠與海藻糖質量比對固體制劑酵母活菌數的影響Fig. 4 Effect of ratio between gum Arabic and trehalose on the number of viable cells in solid preparation

2.3.3 保護劑質量濃度對固體制劑酵母活菌數的影響

圖5 保護劑質量濃度對固體制劑酵母活菌數的影響Fig. 5 Effect of protectant concentration on the number of viable cells in solid preparation

由圖5可知,固體制劑中P. membranaefaciens活菌數隨著保護劑質量濃度的增加而呈現先升高后降低的趨勢,保護劑質量濃度為100 g/L時,活菌數最高。在噴霧干燥過程中,當保護劑質量濃度過低時,對酵母菌保護作用減弱,菌體暴露在高溫下導致其死亡;而當保護劑質量濃度過高時,形成的顆粒直徑增加,為了達到干燥目的,則需延長干燥時間,造成菌體暴露在高溫下的時間延長,從而導致固體制劑中活菌數迅速降低[23-24]。因此后續實驗選擇保護劑質量濃度為100 g/L。

2.3.4 霧化壓強對固體制劑酵母活菌數的影響

圖6 霧化壓強對固體制劑酵母活菌數的影響Fig. 6 Effect of atomization pressure on the number of viable cells in solid preparation

如圖6所示,隨著霧化壓強的增大,固體制劑中P. membranaefaciens活菌數先升高后降低,當霧化壓強為200 kPa時,活菌數最高,為8.08(lg(CFU/g))。在噴霧干燥過程中,增大霧化壓強可以減小液滴大小,提高霧化效果。但霧化壓強過高時,菌體由噴嘴噴出時受到的剪切力增大,導致菌體損傷甚至死亡[25-26]。因此后續實驗選擇霧化壓強為200 kPa。

2.3.5 進風溫度對固體制劑酵母活菌數的影響

圖7 進風溫度對固體制劑酵母活菌數的影響Fig. 7 Effect of inlet temperature on the number of viable cells in solid preparation

進風溫度是影響噴霧干燥效果的主要因素之一[27-29]。由圖7可知,隨著進風溫度的升高,固體制劑中P. membranaefaciens活菌數呈上升趨勢,在110 ℃達到最大值,但與100 ℃無顯著性差異。繼續升高進風溫度至120 ℃,活菌數維持不變。在噴霧干燥過程中,隨著進風溫度的升高,酵母菌表面的水分蒸發加快,干燥時間縮短,單位質量制劑中酵母活菌數增加。但是,酵母菌作為一種熱敏性微生物,雖然保護劑對菌體起到一定的保護作用,但過高的溫度也會導致菌體在噴霧干燥過程中大量死亡[27]。因此,當進風溫度超過120 ℃后,制劑中活菌數迅速降低。綜合考慮溫度對酵母菌活性的影響和能耗等因素,最終選擇100 ℃作為后續實驗的進風溫度。

2.3.6 進料速率對固體制劑酵母活菌數的影響

圖8 進料速率對干粉中活菌數的影響Fig. 8 Effect of feeding rate on the number of viable cells in solid preparation

如圖8所示,隨著進料速率的提高,活菌數呈現先上升后下降的趨勢,當進料速率為15 mL/min時,固體制劑中P. membranaefaciens活菌數最高,為8.35(lg(CFU/g))。進料速率較低時,單位物料承受的熱量增加,導致菌體因受熱過多而出現部分死亡,在進料速率達到15 mL/min時,進料速率與其他影響因素的相互作用達到平衡,制劑中活菌數達到最大。隨著進料速率的進一步增加,單位時間內霧化的小液滴增多,物料表面水分蒸發量減少,最終導致固體制劑中含水量增加,因而單位質量固體制劑中酵母活菌數降低[18,30]。因此后續實驗選擇進料速率為15 mL/min。

2.4 固體制劑的水分含量及保存期間酵母菌的存活率

在單因素試驗優化的條件下(阿拉伯膠與海藻糖質量比1∶1、壁材質量濃度100 g/L、霧化器壓強200 kPa、進風溫度100 ℃、進料速率15 mL/min)進行噴霧干燥,獲得的固體制劑活菌數為2.25×108CFU/g;水分質量分數為4.78%,達到GB 20287—2006《農用微生物菌劑標準》對農用微生物菌劑水分含量的要求。從圖9可以看出,固體制劑中P. membranaefaciens存活率均隨著保存時間的延長而緩慢降低,保存90 d后,P. membranaefaciens的存活率分別為66.97%(25 ℃)和82.91%(4 ℃),表明該固體制劑于4 ℃保存效果明顯優于25 ℃。

圖9 固體制劑在25 ℃和4 ℃保存時酵母菌的存活率Fig. 9 Survival rate of yeast in solid preparation preserved at 25 or 4 ℃

2.5 固體制劑對桃果實軟腐病的控制作用

圖10 25 ℃和4 ℃保存90 d的固體制劑的生防效果Fig. 10 Biocontrol effect of solid preparation stored at 25 or 4 ℃ for 90 days

由圖10可以看出,CK組(陰性對照)和陽性對照組的腐爛率無顯著性差異(P＞0.05)。新鮮酵母、25 ℃和4 ℃保存90 d的固體制劑對桃果實軟腐病均有顯著的控制效果。4 ℃保存90 d的固體制劑的控制效果(發病率37.04%)與新鮮制備的酵母(腐爛率31.48%)雖有顯著性差異(P＜0.05),但控制效果仍然非常明顯。因此該固體制劑于4 ℃保存90 d后,仍然具有良好的防治效力,具備商業化開發和實際應用的價值。

3 結 論

本實驗篩選到1 株對桃果實采后軟腐病具有良好防治效力的拮抗酵母P. membranaefaciens。該拮抗酵母處理的桃果實貯藏72 h后,軟腐病引起的腐爛率(26.23%)顯著低于對照(95.70%),還可以顯著降低桃果實采后自然腐爛率,且對桃果實品質無顯著不良影響。因此,該拮抗酵母應用于桃果實采后病害的控制,可減少化學農藥的使用,對保障食品安全和環境保護具有重要意義,具有良好的應用前景。單因素試驗優化的噴霧干燥法制備該拮抗酵母固體制劑的條件為:保護劑阿拉伯膠與海藻糖的質量比1∶1、保護劑質量濃度100 g/L、霧化器壓強200 kPa、進風溫度100 ℃、進料速率15 mL/min。制備的P. membranaefaciens固體制劑在25 ℃和4 ℃保藏90 d后,酵母存活率分別為66.97%和82.91%。4 ℃保存90 d的固體制劑處理的桃果實采后軟腐病發病率(37.04%)與新鮮制備的拮抗酵母處理的桃果實發病率(31.48%)雖有顯著性差異,但控制效果仍然非常明顯。該拮抗酵母噴霧干燥固體制劑制備技術的建立,可加速拮抗酵母在桃果實采后病害控制中實際應用的進程,促進拮抗酵母生防制劑的產業化。