大珠母貝胰島素相關肽受體基因的克隆與表達

趙子涵，王姿曼，鄧岳文,2，楊創業,2，李俊輝

大珠母貝胰島素相關肽受體基因的克隆與表達

趙子涵1，王姿曼1，鄧岳文1,2，楊創業1,2，李俊輝1

（1. 廣東海洋大學水產學院 // 2. 廣東省珍珠科技創新中心，廣東 湛江 524025）

【】克隆大珠母貝（）胰島素相關肽受體基因，并分析其在不同組織中的表達。利用cDNA快速末端克隆技術（RACE）獲得大珠母貝基因cDNA全長序列。熒光定量PCR技術分析在閉殼肌、鰓、外套膜邊緣區、套膜區、中央區、足和肝胰腺等組織的表達模式。【】基因全長6 009 bp，5′非編碼區（UTR）615 bp、3′UTR 764 bp、開放閱讀框（ORF）長4 629 bp、編碼 1 542個氨基酸。序列分析表明，含有保守結構域Fu、3個FNⅢ結構域和Tyrkc結構域，并含有信號肽和2個跨膜結構域。在大珠母貝各個組織存在差異表達，在鰓、肝胰腺和外套膜邊緣區中顯著高表達。

大珠母貝；胰島素肽相關受體；基因克隆；表達模式

胰島素樣家族是動物生長、發育和代謝的重要調節因子，通過與酪氨酸激酶受體（胰島素受體）結合，在傳遞跨膜信息和調節細胞功能方面發揮重要作用，參與許多生命活動[1-2]。胰島素相關受體（）是胰島素受體（）家族的成員，作為細胞表面受體，是參與調節體內酸堿平衡的細胞外堿性介質代謝傳感器，在腎、胃和胰腺的某些細胞群中表達[3-4]。脊椎動物有不止一個同源的胰島素受體家族成員，而無脊椎動物只有一個胰島素相關肽受體（），這個單一的調節無脊椎動物的生長和代謝[1,5]。胰島素相關肽及其受體已在許多軟體動物中報道，Hamano等[6]在太平洋牡蠣中鑒定分離了胰島素相關肽基因，并分析其結構和表達。在太平洋牡蠣中，胰島素系統調控外套膜生長和殼形成有關的內外上皮細胞水平，還可通過餌料調控整合環境條件的變化[7-8]。馬氏珠母貝（）中胰島素相關肽受體（）與人重組胰島素樣生長因子I（）相互作用，并刺激了卵母細胞的MAPK和PI3K信號通路調節糖原代謝[4]。Lardans等[9]也探討了曼氏血吸蟲幼蟲共培養類胰島素受體（）在曼氏血吸蟲幼蟲胚胎細胞的激活和增殖過程中的可能意義。

大珠母貝（）自然分布在澳大利亞、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等熱帶亞熱帶國家沿海地區，在我國廣東省、廣西省和海南省也有分布，是我國南方海水養殖珍珠貝類的重要組成部分之一，主要用于生產大規格珍珠[10-11]。目前大珠母貝產業主要問題為養殖期間苗種成活率偏低，無法為商業化生產提供足量母貝[12]。通過品種培育與養殖技術研究，能明顯提高養殖成活率。本實驗利用RACE技術克隆了基因的全長序列，并通過熒光定量PCR技術檢測了在不同組織的表達模式，為進一步了解在大珠母貝中生長作用提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用貝取自湛江市徐聞縣承梧村海區，挑選無病害的2齡大珠母貝，剪取閉殼肌（A）、鰓（GI）、外套膜邊緣區（ME）、套膜區（MP）、中央區（MC）、足（F）和肝胰腺（HE），所取組織放入液氮速凍，存于-80 ℃超低溫冰箱，用于熒光定量分析。

RNA提取試劑Trizol，SMARTer TMRACEcDNA Amptification kit，SYBR Premix ExTaqTM購自Thermo Fisher Scientific公司，Reverse Transcriptase M-MLV (RnaseH)、rTaq和Primerstar DNA聚合酶、PDM-19T載體購自Takala Bio公司。

1.2 PmIRR基因全長的克隆

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol提取法提取大珠母貝組織總RNA，利用NanoDropND1000紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。5′RACE和3′RACE模板的獲得參考SMARTerTM RACE cDNA Amolification Kit[13]。

1.2.2序列全長獲取 根據大珠母貝轉錄組數據庫中的unigene序列設計基因特異性引物，將該基因中間分為三段克隆。PCR擴增產物通過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用純化回收試劑盒對目的片段進行純化回收。目的片段通過PDM-19T載體連接，然后轉入DH5a 感受態細胞中。通過LA（含氨芐青霉素 Amp+）固體平板篩選出陽性菌落，挑選單克隆[14]，送至廣州生工生物工程有限公司測序。利用5′端和3′端巢式引物進行擴增。目的片段的回收、轉化、測序等方法同基因中間片段，然后將5′端和3′端拼接獲得全長序列（表1）。

1.3 PmIRR組織差異表達

用熒光定量PCR檢測基因在邊緣膜、套膜、中央膜、閉殼肌、腮、肝胰腺、足組織中的表達模式。以為內參基因，配置10 μL反應體系：10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，滅菌的ddH2O 3.8 μL，cDNA0.4 μL，SYBR? Select Master Mix 5 μL反應程序：95 ℃下預變性 5 min，95 ℃下變性 10 s，60 ℃下退火15 s，72 ℃延伸15 s，40循環，添加 1 個溶解曲線。每個樣品重復 3 次。用2-△△Ct法計算基因在各組織中的相對表達量。通過SPSS19.0對數據進行單因素方差分析，= 0.05[13]。

1.4 生物信息學分析

利用DNAMAN將中間片段、3′端序列和5′序列拼接起來，獲得cDNA全長序列。用在線分析工具ORF Finder 分析開放閱讀框（ORF）并推導出基因的氨基酸序列，用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析氨基酸序列的理化性質，運用在線工具SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測其信號肽。SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）預測PmIRR的保守結構域，用TMHMM Server, v.2.0推測其跨膜結構域，用SOPMA（https://npsa- prabi. ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）推測蛋白質的二級結構。用MEGA6構建PmIRR進化樹。用ClusterW2與其它已知物種相應的IRR氨基酸序列進行同源性對比。

表1 引物序列

Table 1 Sequences and functions of primers

2 結果與分析

2.1 基因克隆與特征分析

克隆得大珠母貝cDNA全長序列。結果顯示，序列全長6 009 bp，其中 5′UTR 為615 bp；3′UTR 為764 bp，包含28 bp的ployA；ORF為4 629 bp，編碼1 542個氨基酸（圖1）。經預測PmIRR有一個信號肽位點（27 ~ 28 bp），為分泌蛋白（圖2）。兩個跨膜結構域位于12-34bp和1005-1027bp，該分子屬于膜蛋白（圖3）。SMART預測其有1個（Fu）結構域、3個（FN3）結構域和1個（Tyrkc）結構域（圖4）。

小寫字母和大寫字母分別表示非編碼區和編碼區；加粗字體為起始密碼子和終止密碼子；雙下劃線的字母表示信號肽；斜體部分表示跨膜結構域；陰影部分表示Fu結構域；單劃線為FN3結構域；方框內為Tyrkc結構域

圖1基因的 cDNA 序列及編碼的氨基酸序列

Fig. 1cDNA and amino acid sequence of

圖2 PmIRR信號肽序列

圖3 PmIRR跨膜結構域預測

圖4 PmIRR蛋白質結構

2.2 PmIRR蛋白質理化性質

預測得PmIRR理論分子質量為75.3 ku；等電點為6.49；負電荷殘基202個，正電荷殘基192個。氨基酸含量分析結果顯示，其脂溶指數（Aliphatic index）為75.89；總平均親水性（Grand averageofhydropathy, GRAVY）為 – 0.531，屬于親水性蛋白（圖5）。經預測，PmIRR的二級結構中，α 螺旋結構占整體的25.36%，延伸鏈占18.48%，β 轉角結構占4.67%，無規則折疊占51.49%（圖6）。

圖5 PmIRR蛋白疏水性

圖6 PmIRR蛋白二級結構

2.3 同源對比與進化樹分析

將美洲牡蠣（）、太平洋牡蠣（）、馬氏珠母貝（）和蝦夷扇貝（）的Tyrkc結構域進行同源性對比（圖7），發現大珠母貝PmIRR的Tyrkc結構域與這些物種的Tyrkc結構域相似度較高，說明IRR氨基酸序列有較高保守性。構建PmIRR與其他物種IRR的進化樹（圖8），發現與雙殼貝類聚為一支，跟親緣性最近，與節肢類動物親緣關系相對較遠。

深藍色表示一致；粉色表示強相似性；藍色表示弱相似性

圖8 鄰接法構建的PmIRR家族系統進化樹

2.4 PmIRR基因組織表達模式分析

結果顯示，在各個組織中均有表達，其中在鰓、肝胰腺、邊緣膜等組織表達量較高，在閉殼肌和足中表達量較低（圖9）。

ME，邊緣膜；MP，套膜區；MC，中央膜；A，閉殼肌；GI，鰓；HE，肝胰腺；F，足； 無共同字母（a、b、c）表示差異顯著(P < 0.05)；凡含一個相同字母者表示差異不顯著（P > 0.05）

3 討論

胰島素相關肽基因及受體在一些軟體動物中已有報道，已被證明對生物的生長和發育有重要意義[9,15-17]。為了解胰島素相關肽受體基因在大珠母貝生長中的作用，本實驗利用RACE技術在大珠母貝中克隆得到胰島素相關肽受體基因的cDNA全長序列。分析發現，該基因氨基酸序列包含1個Tyrkc結構域、3個FN3結構域和1個Fu結構域，多序列比對結果表明其Tyrkc結構域與其他物種的Tyrkc結構域比對結果呈現較高的保守性。Tyrkc結構域為酪氨酸激酶催化結構域在信號傳遞中發揮重要作用[18-19]。Fu結構域能識別特定氨基酸序列，激活重要的多肽和蛋白的前體[20-21]，可能跟IRR的信號傳導機制有關。有報道稱纖維連接蛋白III型FN3結構域是受體的堿敏感特性的重要區域[22-24]。此外，發現IRR有兩個典型的Recep-L-domain結構域，為酪氨酸激酶受體小家族的典型結構域。因此可能發揮胰島素相關肽受體的功能。

為進一步探究在大珠母貝中的功能，本研究通過熒光定量PCR技術檢測其在大珠母貝不同組織中的表達模式，結果顯示，在所檢測的7個組織中均有表達。其中，在鰓組織中顯著高表達，其次是肝胰腺和外套膜邊緣區。在這些特定組織中的高表達現象，表明其可能參與機體的能量代謝。在貝類中，鰓組織是呼吸和濾食的主要器官[25]。研究發現胰島素相關肽()在縊蟶鰓組織中有非常高的表達量，提示胰島素相關肽可能參與肝糖代謝調控或鰓的再生[26-28]。因此，推測參與大珠母貝鰓組織糖原代謝或細胞再生的調控通路。肝胰腺是貝類重要消化和代謝器官[29]，在肝胰腺中高表達可能與其能量代謝的功能相關[5,31]。在外套膜不同區域呈中等表達水平，這與牡蠣[8]的研究結果類似。之前研究已證實外套膜與貝殼的形成有關[32-33]。馬氏珠母貝中存在胰島素相關肽及受體調控通路來調節貝殼的生長和發育[34]，表明很可能參與大珠母貝貝殼的生長。郝瑞娟等[35]探究大珠母貝不同步生長代謝機制，確定了雙殼類不同步生長中的一些代謝途徑和代謝產物。在調控大珠母貝生長發育的作用機制還需進一步研究。

4 結語

本實驗從大珠母貝中克隆獲得胰島素肽相關受體()基因cDNA全長序列，發現該基因在大珠母貝鰓、肝胰腺、外套膜邊緣區表達量相對較高，可能參與大珠母貝貝殼的生長和機體組織發育等生理功能。本研究為進一步探究在大珠母貝中的生理功能提供基礎資料。

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Gene Cloning and Expression Pattern Analysis of Insulin-related Peptide Receptor from

ZHAO Zi-han1, WANG Zi-man1, DENG Yue-wen1,2, YANG Chuang-ye1,2, LI Jun-hui1

（1.//2,524088,）

【】The insulin-related peptide receptor () gene ofwas cloned and its expression patterns in various tissues were analyzed.【】The full-length cDNA sequence ofwas cloned by rapid amplification of cDNA ends (RACE) and the tissue expression pattern of this gene was determined by RT-PCR. 【】The full-length ofwas 6 009 bp. It consist of a 5′UTR (615 bp), a 3′UTR (764 bp) and an open reading frame (4 627 bp) which encoded for 1542 amino acids. d Amino acids analysis of PmIRR showed that it contained a conservative domain Fu, three FNIII domains, a tyrkc domains, a signal peptide and two transmembrane domains.was differentially expressed in different tissues of, and the expression was significantly higher in gills, hepatopancreas and mantle edge.

; insulin-related peptide receptor; gene cloning; expression pattern

Q78; Q959.215+.4

A

1673-9159（2020）05-0034-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.005

2020-04-09

農業產業技術體系專項(CARS-49)；廣東省教育廳珍珠研究創新團隊（2017KCXTD016）；廣東省農業農村廳現代農業產業技術創新團隊專項（2019KJ146）

趙子涵（1996－），女，碩士研究生，研究方向：珍珠培育與加工。E-mail：1922754931@qq.com

鄧岳文（1975－），教授，主要從事珍珠貝遺傳育種與養殖研究。E-mail：dengyw@gdou.edu.cn

趙子涵，王姿曼，鄧岳文，等. 大珠母貝胰島素相關肽受體基因的克隆與表達[J].廣東海洋大學學報，2020，40（5）：34-42.

（責任編輯：劉嶺）