定喘湯對哮喘模型小鼠肺組織炎性因子及NLRP3炎癥小體的影響

李 江 顏延鳳

支氣管哮喘(哮喘)是呼吸內科常見的慢性非感染性氣道炎癥，發生機制常與變態反應有關，其病變特征為嗜酸性粒細胞和2型輔助型T細胞(T helper cell type 2,Th2)因子(包括白細胞介素3、4、5)產生增加，促進免疫球蛋白E(IgE)形成，導致Th2細胞和嗜酸性粒細胞發育、成熟和激活，引起氣道高反應性、黏液產生和氣道重塑[1]。中藥湯劑定喘湯對輕、中、重度哮喘均有顯著療效，但機制尚不明確[2]。有研究顯示，定喘湯能抑制炎癥細胞在氣道黏膜及周圍組織浸潤,抑制氣道重塑[3]。

Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein3，NLRP3)在Nod受體蛋白家族中較為獨特，與其他Nod受體蛋白啟動條件較為單一不同，它存在多種激活方式，參與影響多種疾病，具體激活機制尚未明確。有文獻記載，NLRP3與多種肺部疾病發生和發展有密切關系，NLRP3的下游產物IL-1β能促IL-17分化及炎癥細胞聚集，在哮喘的疾病進程中起重要作用[4]。本實驗制備小鼠哮喘模型，通過檢測其不同時期NLRP3的蛋白表達水平及相關產物(IL-1β，IL-17)含量的變化，同時觀察氣道黏膜及周圍組織的形態，研究定喘湯能否有效抑制NLRP3及相關產物，肺組織炎癥及氣道重塑，探討定喘湯治療哮喘的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器石蠟包埋及切片機(德國Leica公司)；正置顯微鏡(德國Leica公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(美國Media Cybernetics公司)； 蛋白電泳儀及電泳槽(美國Bio-RAD公司)，BIO-RAD ChemiDoc XRS+成像系統(美國BIO-RAD公司)。

1.1.2 主要試劑卵清蛋白(OVA，grade Ⅴ,美國Sigma公司)，明礬佐劑(Imject Alum,美國Pierce公司)，內毒素(LPS,美國Sigma 公司)；細胞因子IL-1β、 IL-4、IL-17檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；免疫組化抗體rabbit anti-NLRP-3(上海Abways公司), rabbit anti-caspase-1(美國Proteintech公司)，Elite ABC Kit(美國Vector 公司)；蛋白電泳(western blot)抗體NLRP-3(上海Abways公司)，caspase-1(美國Proteintech公司)，IL-1β抗體(英國Abcam公司)，多克隆兔抗β-actin抗體(美國Bioworld公司)。

1.1.3 主要藥物定喘湯(Dingchuantang，DCT)由南京市中西醫結合醫院自制，根據《扶壽精方·痰門》制作定喘湯濃縮湯劑，處方組成：白果(去殼炒黃)9 g，麻黃9 g，紫蘇子6 g，甘草3 g，款冬花9 g，杏仁9 g，桑白皮9 g，黃芩6 g，法半夏9 g(飲片來源：南京鶴齡藥事服務有限公司)。按處方精確稱取藥材飲片，每次加水500 ml，浸泡30 min，煎煮1 h，煎煮2次，合并煎液，用8層紗布過濾湯液，濃縮至48 ml，配置成生藥，濃度為1.43 g/ml的母液，裝于無菌瓶中，存放至4 ℃冰箱，供小鼠灌胃給藥。按體表面積換算公式計算得定喘湯小鼠灌胃劑量為9 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組本實驗采用2月齡BALB/c小鼠(雌雄不拘)48只，均由南京醫科大學動物實驗中心提供，動物飼養、管理及使用均嚴格按照《南京醫科大學實驗動物管理規范》的要求進行，動物號SCXK(蘇)2016-0002。將小鼠按體質量隨機分為4組，分別為哮喘治療組(OVA+DCT)，哮喘觀察組(OVA+NS)，定喘湯對照組(NS+DCT)，空白組(NS+NS)，每組12只。

1.2.2 建模及給藥OVA+DCT組及OVA+NS組小鼠在實驗的第0、7天，用20 μg OVA溶于100 μl明礬佐劑腹腔注射，在第28、29、30天取100 μg LPS溶于40 μg生理鹽水滴鼻，第31～37天，5% OVA溶液(1 g OVA溶解于20 ml生理鹽水中)每日霧化吸入30 min，復制中性粒細胞為主的哮喘小鼠模型， NS+DCT組及NS+NS組同時間采用等量生理鹽水替代[5]。OVA+DCT組及NS+DCT組在第31天至第37天，采用定喘湯灌胃液1 ml灌胃(用9 ml定喘湯母液與20 ml生理鹽水混合，配置定喘湯灌胃液，用量為20 ml/kg，每只小鼠1 ml， 2 h內分3次灌注，注意防嗆咳)，每天1次；OVA+NS組及NS+NS組小鼠以生理鹽水1 ml進行灌胃。

1.2.3 BALF中IL-1β、IL-4、IL-17水平檢測末次灌胃結束24 h后，每組取6只動物，采用3%戊巴比妥鈉(4 mg/100 g體質量)麻醉固定后，采集肺泡灌洗液(BALF)，4 ℃，1500 r/min離心5 min，收集上清，采用ELISA試劑盒，具體步驟按檢測試劑盒說明書操作。在酶標儀波長450 nm上讀取吸光度值，通過標準曲線換算成相應濃度，檢測BALF中IL-1β、IL-4、IL-17的表達。

1.2.4 肺組織NLRP3和caspase-1表達的免疫組化檢測另取每組6只動物，取左肺中葉4%多聚甲醛固定、酒精梯度脫水、石蠟包埋切片(片厚5 μm)保存。采用ABC法：切片經脫蠟、水化，煮沸法行抗原修復后，一抗rabbit anti-Caspase-1(1：200)；rabbit anti-NLRP3(1：200)4 ℃孵育過夜；生物素標記的羊抗兔IgG(1:200)室溫孵育1 h， 滴加Elite ABC混合液室溫孵育30 min，DAB底物室溫5 min顯色，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察攝片，采用Image Pro Plus6.0半定量分析單位面積內NLRP3及caspase-1的積分光密度(IOD)值[6]。

1.2.5 western blot檢測取左肺下葉稱重，20 mg加入100 μl蛋白裂解液在勻漿器中研磨(全程冰上操作)，13000 rpm，15 min,4 ℃離心。吸取上清，采用BCA方法進行蛋白定量。進行SDS-PAGE 電泳、轉膜5%脫脂奶中室溫封閉1 h。用封閉液稀釋好NLRP-3抗體(1∶1000)、Caspase-1抗體(1∶2000)和IL-1β抗體(1∶2000)封入薄膜中，室溫震搖過夜。PBST洗膜，10 min/次,3～4次。加入封閉液配制的二抗羊抗兔 (1∶2000)與膜一起封入薄膜中，室溫搖床60 min。PBST洗膜，10 min/次,3～4次。現配顯影液，均勻灑于膜上,成像。采用灰度分析軟件Image Pro Plus 6.0軟件分析、計算各蛋白條帶的光密度值。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據分析，定性資料采用χ2檢驗，半定量數據采用非參數檢驗，定量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-17比較BALF中，NS+NS組與NS+DCT組各炎癥因子無顯著差異。與NS+NS組相比，OVA+NS組與OVA+DCT組中IL-1β、IL-4和IL-17的表達均上升(P<0.05)。OVA+NS組與OVA+DCT組相比，OVA+DCT組中IL-1β(P<0.01)、IL-4(P<0.05)和IL-17(P<0.001)含量均顯著下降。見表1，圖1。

表1 肺泡灌洗液(BALF)中不同組動物炎性因子的含量

圖1 肺泡灌洗液(BALF)中不同組動物炎性因子的含量

2.2 各組小鼠肺組織免疫組化比較NLRP3及caspase-1結果顯示：NS+NS組與NS+DCT組小鼠氣道上皮基本完整，無明顯炎性因子浸潤，積分光密度值(IOD)組間無顯著差異(P>0.05，圖2A-D)。與NS+NS組相比，OVA+NS組與OVA+DCT組小鼠氣道上皮缺損，周圍可見炎性因子浸潤；2組NLRP3、caspase-1的IOD均顯著升高(P<0.001)，而相對較OVA+NS組,OVA+DCT組NLRP3的IOD顯著降低(P<0.01)，caspase-1的IOD也顯著降低(P<0.001)(圖2 A-D)。

注：A NLRP-3免疫組化；B caspase-1 免疫組化； C NLRP-3積分光密度值；D caspase-1積分光密度值圖2 不同組炎性小體相關指標改變

2.3 各組小鼠肺組織內NLRP-3、caspase-1、IL-1β及β-actin表達比較Western blot 結果顯示：與NS+NS組相比，OVA+NS組的IL-1β、NLRP3、caspase-1的蛋白表達均上調；相較于OVA+NS組，OVA+DCT組中IL-1β、NLRP3、caspase-1的蛋白表達均下調。見圖3。

圖3 IL-1β, NLRP-3, caspase-1的蛋白表達變化

3 討論

哮喘屬于中醫學“哮病”范疇。患者因先天稟賦不足、疾病遷延、體虛失養或接觸異物，致氣血津液失司，痰宿于肺。每外邪束肺，陽氣郁內，易化痰熱，故應祛邪宣肺，化痰清熱。定喘湯最早出自《扶壽精方·痰門》，治療熱哮效果顯著，后在不同地區不同時代醫家均有相似驗方記載。定喘湯由白果、麻黃、紫蘇子、甘草、款冬花、杏仁、桑白皮、黃芩及半夏組成，此方集辛、澀、苦、甘四味，合宣、降、清三法[7]，邪去郁解，氣暢痰消。臨床研究表明定喘湯治療不同程度哮喘均有療效[2]，本課題組前期研究表明，定喘湯能降低Th2細胞轉錄因子GATA-3，抑制Th2細胞亞群表達，從而扭轉Th1/Th2細胞亞群失衡[8]。傳統Th1/Th2平衡學說對哮喘機制解釋尚有不足，Th1/Th2失衡造成嗜酸性粒細胞聚集性哮喘，但對以中性粒細胞為主的重癥哮喘，難治性哮喘難以很好解釋。近期研究發現Th17也參與了哮喘發病過程， Th17/Th2失衡與中性粒細胞哮喘、重癥哮喘及難治性哮喘有密切聯系[9，10]。

正常生理條件下，NLRP3在細胞質內處于自我抑制狀態，為出現可被識別的微生物結構單元或病原相關分子模式或損傷相關分子時，NLRP3能夠招募凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和半胱天冬酶(caspase)-1組成的多蛋白復合物形成NLRP3炎癥小體。活化的炎癥小體可大量分泌IL-1β、IL-8及Caspase-1[11]。IL-1β可以與IL-6和趨化因子招募中性粒細胞，促進Th17淋巴細胞分化，進而增加IL-17，IL-22的分泌[12],在哮喘過程中起到重要作用，進而提示NLRP3炎癥小體可能與哮喘病情嚴重程度正相關。

BALB/c小鼠具有遺傳基因單純，個體差異較小，價格較低，飼養場地適中，又有較好的炎癥、免疫反應等優點[13]，OVA聯合LPS具備更強的免疫原性和抗原性，本研究采用OVA聯合LPS致敏BALB/c小鼠作為評價模型。OVA聯合LPS致敏的OVA+NS組及OVA+DCT組與NS+NS組及NS+DCT相比，小鼠肺組織炎性指數顯著上升，肺泡周圍出現大量炎性因子聚集，BLAF中IL-1β、IL-4、IL-17含量顯著上升，上述結果說明OVA-LPS-OVA小鼠造模成功，并且出現Th17/Th2失衡。定喘湯干預治療的OVA+DCT組BLAF中炎性因子IL-1β、NLRP3、caspase-1的蛋白表達較生理鹽水干預的OVA+DCT組均下降。同時，NS+NS組與NS+DCT組小鼠在BLAF中炎性因子水平、肺組織中蛋白水平均無顯著差異，表明定喘湯對于正常生理狀態下小鼠肺組織炎癥及相關因子無影響。本實驗結果提示定喘湯能抑制NLRP3炎癥小體，降低IL-1β、IL-17含量，減少炎性因子募集，減輕氣道及肺組織中炎癥反應和提高抗炎作用，改善氣道結構反應，緩解哮喘癥狀。此外，定喘湯可以同步降低IL-4及IL-1β、IL-17的表達，改善Th1/Th2和Th2/Th17平衡，也從側面解釋了臨床應用中定喘湯不論對于嗜酸性粒細胞哮喘還是中性粒細胞哮喘等輕、中、重度哮喘均有良好療效。

本研究主要集中探索成方“定喘湯”對于NLRP3炎癥小體及相關炎性因子在肺組織中的機制研究，此外，NLRP3炎癥小體異常激活的影響不局限于肺組織，常能引發或加重某些全身性疾病，例如2型糖尿病炎癥性腸病和阿爾茲海默病等[15]。后續研究中，我們繼續以中醫理論整體觀念為指導，如肺與大腸相表里等經典論述出發，結合基礎科學研究，探討分析，擴大定喘湯的治療適應范圍，更好地體現中醫整體論治的特點。