朱砂根種子組織培養(yǎng)與愈傷組織的誘導

侯欣躍　謝鈺鑫　于復欣　馬宇田　路艷

摘 要：目的：研究藥用觀賞植物朱砂根種子組織快繁技術和試管苗不同部位愈傷組織誘導，為其轉基因、毛狀根誘導、有效藥用成分研究與朱砂根產業(yè)化生產苗木提供依據。方法：選用當年采收，籽粒飽滿，沒有殘缺或畸形，沒有病蟲害的種子為材料，考察不同基本培養(yǎng)基、植物激素對朱砂根種子發(fā)芽誘導、繼代及愈傷組織誘導。結果：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L培養(yǎng)基配方比較適用于朱砂根種子初代培養(yǎng);MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基配方比較適用于繼代培養(yǎng)。不同外植體中，朱砂根莖段有利于促進愈傷組織形成。

關鍵詞：朱砂根;種子;組織培養(yǎng);愈傷組織

中圖分類號 S567.19文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）13-0025-04

朱砂根（Ardisia crenata Sims），又名大羅傘、富貴籽，是紫金牛科（Myrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）觀賞藥用植物[1]。在我國，主要零星分布于西藏東南部至臺灣，湖北至海南島等熱帶與亞熱帶地區(qū)[2]。作為傳統(tǒng)藥用植物，朱砂根具有祛風除濕、祛痰止咳、降血壓、抗癌抑菌、抗HIV和抗腫瘤等重大功效[3]。朱砂根自然繁殖緩慢，扦插和壓條繁殖系數相對較低，播種繁殖易產生性狀分離，阻礙了朱砂根的產業(yè)化開發(fā)和利用。植物組織培養(yǎng)在離體條件下獲得再生完整植株，生長周期短，繁殖率高，并能保持優(yōu)良品種的遺傳特性，是拯救瀕危植物、生產具有經濟價值產品、實現工廠化生產的重要技術方式。黃美娟等[4]報道了朱砂根莖段組織培養(yǎng)和快速繁殖的培養(yǎng)條件;丁力等[5]研究了不同植物激素對朱砂根愈傷組織誘導不定芽的影響;陳俊暉等[6]建立了金邊朱砂根的組培快繁體系;蔡長福等[7]探討了朱砂根組織培養(yǎng)防褐化的技術措施。朱砂根組織培養(yǎng)成苗過程比較漫長，獲取無菌苗的外植體材料一般為帶芽莖段[8-9]，以種子為外植體材料的研究較少。帶芽莖段含真菌、細菌較多，消毒不徹底極易污染或在組培過程中極易褐化死亡。朱砂根的種子數量繁多、取材方便、消毒容易、褐化率低，是最理想的外植體材料。本研究以朱砂根當年結實種子為外植體材料，通過不同的消毒方法、不同濃度細胞分裂素、生長素的組合使用，開展朱砂根種子離體培養(yǎng)和誘導愈傷組織形成的研究，初步建立朱砂根種子離體快繁技術和方法，為朱砂根工業(yè)化生產苗木、野生資源保護與次生代謝化學成分研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理 實驗在濰坊學院生物與農業(yè)工程學院重點實驗室進行。從濰坊廣發(fā)花卉市場購買朱砂根盆栽（帶果實），采摘當年籽粒飽滿、沒有病蟲害的健壯種子。無菌播種前對種子進行處理，從植株上摘取朱砂根的成熟果實，去掉果皮和果肉，在洗衣粉溶液中浸泡30min，搓洗干凈，然后用紗布包住，流水下沖洗5～6h，用無菌水沖洗3遍，置于無菌瓶中用無菌水浸泡24h（每隔12h換水1次）。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒時間試驗 將處理好的朱砂根種子置于超凈工作臺上，先用75%酒精消毒20s，無菌水漂洗3～4次;用0.1%HgCl2（升汞）浸泡4min，無菌水漂洗3～4次，再用0.1%HgCl2（升汞）浸泡2、3、4、5、6min，無菌水漂洗5次，無菌濾紙吸干水分后將種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上，每瓶接種3粒，共接種10瓶，2次重復。觀察種子的萌發(fā)情況、褐化情況與污染情況，30d后統(tǒng)計發(fā)芽率、褐化率與污染率。

1.2.2 種子無菌接種培養(yǎng)基的篩選 以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，將種子接種到不同激素配方的培養(yǎng)基上（表1）。培養(yǎng)條件：溫度（25±1℃），光照12h/d，光照強度1000lx，光照12h/d。50d后觀察試管苗生長情況。

1.2.3 朱砂根種子試管苗繼代培養(yǎng)基篩選 將生長健壯的種子試管苗剪成1.5～2.0cm長的帶芽莖段，接種到繼代培養(yǎng)基中，注意形態(tài)學上下端不要顛倒，每瓶接種2～3個，繼續(xù)培養(yǎng)。以MS培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，附加不同濃度植物激素組合配方（表2）。觀察莖段和叢生芽生長情況，30d后統(tǒng)計叢生芽增殖系數。培養(yǎng)條件：溫度（25±1℃），光照12h·d-1，光照強度2000lx，光照12h/d。

1.2.4 試管苗不同外植體愈傷組織誘導 以MS+6-BA0.2mg/L+NAA1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L為基本培養(yǎng)基，接種朱砂根無菌苗的根、莖段和嫩葉，觀察愈傷組織的生長情況，30d后統(tǒng)計出愈率和愈傷組織增殖系數。培養(yǎng)條件：溫度（25±1℃），光照12h·d-1，光照強度2000lx，光照12h/d。

1.3 數據統(tǒng)計 采用Excel2010和SPSS20.0統(tǒng)計軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析。

啟動率（%）=（發(fā)芽的種子數/試驗種子總數）×100;褐化率（%）=（褐化的種子數/試驗種子總數）×100;污染率（%）=（污染的種子數/試驗種子總數）×100;出愈率（%）=（出現愈傷組織數/外植體接種數）×100。叢生芽增殖系數=（再生叢生芽數/接種數）×100;愈傷組織增殖系數=（30d時愈傷體積/接種時愈傷體積）×100。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對種子無菌萌發(fā)的影響 無菌接種后第2d開始觀察不同消毒時間處理后種子的生長情況。由表3可以看出，滅菌時間不同，消毒效果不同，污染率不同。種子接種3～7d后，污染的種子周圍培養(yǎng)基開始出現水漬狀菌圈，隨后種子表面長出霉菌。菌圈顏色加深，表現為黃白色、白色、黑色，黑色居多、菌毛較長，形成較大菌圈，培養(yǎng)基表面形成一層墨綠色菌層。在此期間，若發(fā)現接種的種子未全部污染，可將未污染種子及時轉移進新培養(yǎng)基中繼續(xù)觀察。種子接種10d后若種子開始長菌污染，主要原因為種子內生菌污染或培養(yǎng)過程污染。

消毒時間6min，種子全部污染。延長消毒時間到7min，種子發(fā)芽率為36%，污染率最高54%，將時間延長到8、9min，發(fā)芽率相同污染率接近，將時間延長至10min，污染率有所下降，種子周圍培養(yǎng)基輕微黃色，并且未發(fā)芽未污染種子所占比重有所增加。結果表明，滅菌時間過短消毒不徹底，污染率增加，滅菌時間過長則產生毒害作用，降低種子活性，種子褐化死亡，影響發(fā)芽。因此選用75%酒精消毒20s，無菌水漂洗3～4次，用0.1%HgCl2消毒總時長達到8～9min，朱砂根種子發(fā)芽率為56.7%，污染率36.7%，消毒效果較好。

2.2 不同激素組合對種子發(fā)芽的影響 多數種子在接種10d后開始萌發(fā)，根點變綠，慢慢突破種皮，伸長成綠色胚根（圖1A）。接種50d后開始長出第1片葉，90d后朱砂根試管苗株高平均4.5cm，生長健壯。不同濃度和配比的激素組合，對朱砂根種子發(fā)芽具有顯著影響。由表4可知，A4培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L發(fā)芽率比較高，發(fā)芽率可達到77.78%，A2培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L種子發(fā)芽率為70.59%以上，A2大部分朱砂根種子發(fā)芽時間早于A4。NAA濃度相同，相對低濃度的6-BA有利于種子萌發(fā)，6-BA濃度相同，相對高濃度NAA有利于種子萌發(fā)。

2.3 不同激素組合對試管苗繼代培養(yǎng)的影響 朱砂根試管苗莖段接種10d后，莖段頂端保留小葉開始生長，15d后側芽開始生長，莖段切口產生愈傷組織，30d后側芽長出新葉（圖1C），60d后長成新的試管苗（圖1D）。不同激素組合對試管苗的繼代培養(yǎng)影響顯著。由表5可見，MS+6-BA1.0mg/L+ NAA0.1mg/L比較適合朱砂根試管苗繼代誘導芽生長，側芽啟動率為88.42%，明顯高于其他處理。在本研究中，經過一段時間培養(yǎng)，繼代苗會在莖段和培養(yǎng)基接觸處出現褐化現象，影響試管苗的生長發(fā)育。在培養(yǎng)基中加入少量活性炭、及時更換培養(yǎng)基可以有效抑制褐化現象。

2.4 朱砂根試管苗不同部位愈傷組織誘導與繼代培養(yǎng) 愈傷組織分化難易程度與植物不同部位有著密切關系。15～20d后，大部分外植體切口處開始出現愈傷組織（圖1E）。莖段切口出現白色略帶米黃色愈傷組織，愈傷組織結構緊密;葉片顏色變得鮮綠并開始膨大，未出現愈傷組織，部分葉片邊緣切口發(fā)黑;根部膨大，愈傷組織不明顯，部分根段周圍培養(yǎng)基發(fā)黃。由表6可見，朱砂根的莖段相對于根與葉更適合誘導愈傷組織，褐化少，愈傷組織分裂能力強，長勢好。愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基，10d后愈傷組織不斷膨大生長，由白色略帶黃綠色逐漸轉變?yōu)榘咨咨鷤M織結構松散。愈傷組織生長迅速，外層愈傷組織容易褐化，有的分化出小苗（圖1F）。下一次繼代培養(yǎng)時可以將外層松散愈傷組織切除，繼代培養(yǎng)基中加入少量活性炭，可有效抑制褐化。

3 結論與討論

3.1 結論 本次研究結果可知，無菌播種前，種子用75%酒精消毒20s，0.1%HgCl2（升汞）分2次消毒，消毒總時長達8～9min消毒效果最好。細胞分裂素與生長素不同濃度配比影響朱砂根種子萌發(fā)和芽苗的繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L適合于朱砂根種子無菌播種培養(yǎng)，種子發(fā)芽率可達到77.78%;培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L適合于種子試管苗繼代培養(yǎng)，誘導率為88.42%。在朱砂根組織培養(yǎng)過程中，及時更換培養(yǎng)基，加入少量活性炭可有效抑制組織褐化。不同外植體中，朱砂根莖段比較適合促進愈傷組織形成，誘導率為83.33%，同時愈傷組織生長狀況良好。

3.2 討論

3.2.1 消毒方法 外植體的無菌消毒是植物離體培養(yǎng)技術成功的關鍵。植物材料不同，采用的消毒劑的種類和濃度不同。胡海英等[10]對金蓮花種子采用無毒級殺菌消毒劑愛力克與75%乙醇配合消毒， 消毒效果最佳;蔡長福等[7]從消毒液的種類和濃度等方面，探討了朱砂根外植體消毒的有效方法。本研究對原有的朱砂根種子消毒處理方法進行改進，有效提高了消毒效果。增加流水沖洗時間至5～6h，置于無菌瓶中用無菌水浸泡24h，增加75%酒精消毒時間至20s，能夠消滅大部分的細菌，同時不影響種子的活性。HgCl2作消毒劑，種子消毒過程中消毒時間過久會出現毒害現象，影響種子萌發(fā)[11]。本研究將升汞消毒時間分成2段，減緩了升汞對種子的毒害作用，起到很好的消毒效果。除此之外，本研究采用增加升汞濃度、升汞與吐溫配用等消毒措施，均沒有取得良好效果。朱砂根外植體污染率高，與朱砂根生長環(huán)境避光陰濕、微生物活性強，果實堅硬、種子含有內生菌等因素有關，增加了消毒難度。

3.2.2 植物激素 朱砂根種子無菌培養(yǎng)過程中，植物激素起到重要作用。植物不同生長時期，所需的激素種類和濃度不同。本研究主要探討了6-BA，NAA 2種植物激素對朱砂根種子與叢生芽誘導的影響。研究發(fā)現，種子萌發(fā)時期NAA生長素需要量低于幼苗時期。在種子離體培養(yǎng)過程中7d內需要重點觀察，若出現污染及時轉移培養(yǎng)基補救可以有效降低污染率。關于朱砂根無根苗接種到培養(yǎng)基中，切段不帶頂芽葉腋中的小芽生長較快，帶頂芽生長緩慢，研究結果與馬明東等[8]的結果相似。7d繼代培養(yǎng)，幼苗生長緩慢，腋芽數量少，隨著繼代次數增加，單株試管苗腋芽數量也開始增多，可逐漸達成擴繁效果。

3.2.3 愈傷組織因素 組織培養(yǎng)過程中，植物細胞損傷、無菌環(huán)境等條件會促進愈傷組織形成。愈傷組織是由植物細胞分化的薄壁細胞，可進行脫分化形成新植株。朱砂根組織培養(yǎng)中形成的愈傷組織大多呈現黃白色。在促進朱砂根形成愈傷組織過程中，朱砂根不同外植體愈傷組織誘導其莖段產生愈傷組織產量高于葉與根，與黃素華等[12]的研究結果相似。葉片和根段愈傷組織分化能力弱，切口受創(chuàng)相對面積大，傷口處分泌的酚類化合物被氧化為醌，醌通過非酶促反應產生有色物質而導致組織褐變，易向培養(yǎng)基內釋放褐化物質，使培養(yǎng)基變黃。導致細胞失去愈傷組織分化能力，褐化死亡。莖段分裂能力最強，褐化少分化愈傷組織時間短，適用于誘導愈傷組織[13]。

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