三苯基錫和聚苯乙烯微塑料聯合暴露對胭脂魚幼魚的急性毒性效應

張瀟峮，王 偉，羅鳴鐘，柴 毅，沈子偉，倪朝輝

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所,農業農村部長江中上游漁業資源環境科學觀測實驗站，武漢 430223；2.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

三苯基錫(triphenyltin,TPT)是一類重要的環境污染物[1,2]，被廣泛應用于農業、工業和生物醫學方面，其使用量呈現逐年遞增趨勢。三苯基錫污染普遍存在我國水體環境中，東南沿海港口水域三苯基錫平均含量為0.7 mg/L[3]，青島石老人海水浴場的三苯基錫濃度更是高達53.2 ng/L[4]。經調查發現，三峽水庫已經受到三苯基錫污染物不同程度的影響[5]。

微塑料(Microplastics,MPs)是指直徑小于5 mm的塑料顆粒[6]。環境中的塑料垃圾或仍在使用的大塊塑料，在物理磨損、化學降解和生物降解的共同作用下降解為粒徑更小的塑料，逐漸形成微塑料[7,8]。微塑料性質穩定，進入環境后難以被降解，可在風力、河流、洋流等外力作用下進行長時間、長距離的遷移[9]，對生態環境造成持久的影響，已成為當前重要的全球性環境問題。微塑料對于海洋環境的污染已早有研究[10]，而近年來在淡水水域也發現了不同程度的微塑料污染，其中包括我國的長江流域及三峽水庫庫區[11]等。由于微塑料具有疏水性強、比表面積大的特點，已有許多研究表明微塑料可吸附水體中其他污染物，形成復合污染，這也導致風險源對水生生物的污染脅迫途徑愈發復雜，會造成不可預知的生態風險[12,13]。目前，有關微塑料與水環境中其他污染物復合污染的研究剛剛起步，且多集中于多氯聯苯、多環芳烴、多溴代二苯醚等傳統有機污染物[14-16]，有關微塑料與其他新興水體污染物之間的相互作用研究十分有限。

胭脂魚(Myxocryprinusasiaticus)屬于鯉形目(Cypiniformes)胭脂魚科(Catostomida)胭脂魚屬(Myxocyprimus)，本屬在我國僅胭脂魚1種，主要分布于我國長江的干支流和附屬湖泊以及閩江流域[17]。近年來，由于過度捕撈及產卵場、棲息地生境退化，胭脂魚資源量已明顯下降。目前閩江的胭脂魚種群幾近絕跡，而長江中的胭脂魚分布區也在逐漸縮小[18]。胭脂魚現已被列為國家二級瀕危保護動物[19]。為保護這一物種，采取了建立保護區、禁捕、增殖放流等保護手段[20]，三峽水庫庫區即為胭脂魚幼魚的重要放流區域。目前已有研究對胭脂魚的基礎生物學、營養學[21-23]，以及以農藥和殺菌劑等為目標污染物的環境毒理學進行了探討[24]。尚未有關于胭脂魚在有機污染物和微塑料水體暴露下的生理毒理學的研究報道。本實驗研究了胭脂魚對三苯基錫與微塑料聯合暴露的急性毒性效應，旨在探討水環境中三苯基錫和微塑料對胭脂魚幼魚的影響，為胭脂魚的資源保護提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

胭脂魚由石首市長吻鮠國家級良種場提供，挑選外觀正常，體質健康，規格接近的個體 [體質量(0.325±0.065)g，體長(2.7±0.1)cm]用于實驗。實驗前暫養于實驗室塑料箱中，用水為曝氣的自來水，氣泵連續充氣，溫度為(24.0±1.5)℃，溶氧≥6.0 mg/L，光照周期12 h光照 ∶12 h黑暗。

1.2 暴露液的配制

三苯基錫儲備液：取0.1 g三苯基錫(aladdin industrial corporation)溶于100 mL二甲基亞砜(天津市科密歐化學試劑有限公司)中，配制成1 g/L的三苯基錫儲備液，避光4 ℃保存。

三苯基錫標準中間使用液：移取1 g/L的三苯基錫儲備液1 mL,用蒸餾水定容至1 000 mL，此三苯基錫標準使用液的濃度為1 mg/L。

微塑料溶液：聚苯乙烯(polystyrene,PS)微球(無錫瑞格生物科技有限責任公司)粒徑為(200±20)nm，密度為1.05 g/cm3，變異系數(CV)<6%，乙醇中溶脹率為5%～10%，微球電鏡形貌如圖1所示。實驗前用純水稀釋到所需濃度。

圖1 聚苯乙烯微球形貌表征Fig.1 Morphology characterization of polystyrene microspheres

1.3 實驗方法

通過預實驗，觀察在48 h內的情況，得出胭脂魚的最大無死亡質量濃度和全部致死濃度。依照預實驗的結果來設置正式實驗的藥品濃度梯度。

1.3.1 三苯基錫急性毒性實驗

實驗期間不投餌，為保證實驗藥液質量濃度，每隔24 h更換藥液1次。實驗采用半靜態方式水生生物急性毒性實驗法[25]。根據預實驗結果按等對數間距設計6個濃度梯度(表1)。每濃度組10尾胭脂魚幼魚，設3個平行組，1個空白對照組。實驗開始后12 h連續觀察胭脂魚幼魚的反應及運動情況并記錄，在24、48、72、96 h觀察死亡數據并及時清出死亡個體。空白對照組有魚死亡，換魚重新馴養試驗。

表1 三苯基錫的濃度梯度

1.3.2 三苯基錫和聚苯乙烯聯合毒性實驗

在LC50實驗基礎上，分別挑選高濃度組三苯基錫(0.126 mg/L)和低濃度組三苯基錫(0.032 mg/L)與聚苯乙烯微球溶液(0.1、1、10 mg/L)聯合對胭脂魚幼魚的96 h急性毒性作用。每個濃度組設置三個平行實驗，每個系列設置一個空白對照組。

1.4 數據處理

采用寇式法(Karber)計算半致死濃度(LC50)、安全濃度(SC)和半致死濃度的95%置信區間(CI)，并做實驗濃度對數為橫坐標與死亡率為縱坐標的直線回歸方程，利用藥物毒性蓄積程度系數(MAC)來分析胭脂魚體內對藥物的蓄積、降減變化。采用T檢測比較，三苯基錫與三苯基錫+聚苯乙烯處理下胭脂魚存活情況是否存在差異，當P<0.05時認為差異顯著，P<0.01時差異極顯著。相關計算公式如下：

LogLC50=Xm-d(∑p-0.5)

SC=48 hLC50×0.3/(24 hLC50/48 hLC50)2

95%CI=LogLC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

MAC=100% ×(t1LC50-t2LC50)/(t0LC50-tmLC50)

上式中：Xm為消毒劑最大濃度的對數，d為相鄰濃度的對數差值，p為死亡率(%)，∑p為各組死亡率之和，g為存活率(%)，n為每組實驗胭脂魚幼魚的尾數；t1LC50和t2LC50為觀察時段t1和t2的半致死濃度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分別為實驗初始、結束時半致死濃度(mg/L)。

2 結果

2.1 中毒癥狀

實驗開始6 h，三苯基錫高濃度組(濃度Ⅴ和Ⅵ)的胭脂魚幼魚開始興奮，游動迅速，上下攪動水體，趨邊游動或沖撞塑料箱沿壁。中低濃度組(濃度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)的胭脂魚幼魚出現應激反應，如浮頭、靜止不動、呼吸不暢等癥狀，但過一段時間后逐漸恢復正常狀態。6 h后高濃度組的胭脂魚幼魚身體逐漸地失去平衡，漂浮于水面，呼吸逐漸減弱，身體扭曲，翻轉，游動緩慢，有部分側翻，最后沉底死亡。

2.2 三苯基錫的急性致死效應

如表2所示，在96 h的急性毒性實驗中對照組的胭脂魚幼魚均未發生死亡，三苯基錫處理組胭脂魚幼魚的死亡率均隨藥物濃度增加，實驗時間延長而上升。低濃度組(濃度Ⅰ)的三苯基錫對胭脂魚幼魚的急性致死效應最小，96 h的死亡率不超過10%；中高濃度組(濃度Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ)的三苯基錫對胭脂魚幼魚的急性致死效應較大，96 h各組均存在100%的死亡率。

表2 胭脂魚幼魚在三苯基錫作用下的死亡率

2.3 半致死濃度和毒性蓄積效應

根據公式計算出三苯基錫對胭脂魚幼魚的24、48、72和96 h的LC50、95%CI、MAC和SC(表3)。LC50均隨實驗時間的延長而下降，三苯基錫對胭脂魚幼魚24 h、48 h、72 h和96 h的LC50分別為0.112、0.053、0.026、0.017 mg/L，SC為0.003 mg/L，三苯基錫對胭脂魚幼魚的MAC隨實驗時間延長而下降，且下降較快。

表3 三苯基錫對胭脂魚幼魚的半致死濃度、藥物毒性蓄積程度系數和安全濃度

2.4 三苯基錫與聚苯乙烯聯合的毒性效應

T檢測結果表明，與聚苯乙烯聯合暴露對三苯基錫的毒性影響顯著，并且聚苯乙烯質量濃度和暴露時間兩者間存在顯著的交互作用。由圖2可知，在三苯基錫低濃度組，聯合暴露于0.1 mg/L聚苯乙烯的胭脂魚幼魚，72 h后的死亡率明顯低于其他處理組。由圖3可知，在三苯基錫高濃度組，聯合暴露于1 mg/L聚苯乙烯的胭脂魚幼魚，24 h的死亡率明顯低于其他處理組；聯合暴露于1 mg/L及10 mg/L聚苯乙烯的胭脂魚幼魚，48 h的死亡率明顯低于其他處理組，且在72 h的死亡率均未達到100%。表明聚苯乙烯對三苯基錫的毒性效應具有延緩作用。

圖2 低濃度三苯基錫與聚苯乙烯聯合的急性毒性比較

圖3 高濃度三苯基錫與聚苯乙烯聯合的急性毒性比較Fig.3 Comparison of joint acute toxicity of high concentration TPT and PS on juvenile M.asiaticus

3 討論

3.1 三苯基錫對胭脂魚幼魚的急性毒性特征

LC50是評價污染物對水產動物急性毒性的重要指標，根據國家環保總局發布的毒性分級標準，急性毒性96 hLC50<0.1 mg/L為劇毒，0.1～1.0 mg/L為高毒，1.0～10.0 mg/L為中毒，>10.0 mg/L為低毒。已有研究多集中于三苯基錫對于水層中底部水生生物的毒性影響，如羽搖蚊幼蟲、小錐實螺、顫蚓[26]和海膽[27]等，結果表明三苯基錫毒性較大。宋志慧等[28]研究發現,三苯基錫對斑馬魚的96 hLC50為0.012 mg/L，而本實驗結果顯示三苯基錫對胭脂魚幼魚的96 hLC50為0.017 mg/L，可見三苯基錫對魚類是劇毒物質，三苯基錫污染會對水生生物產生巨大的傷害。

3.2 三苯基錫在胭脂魚幼魚體內的蓄積與降減的特征分析

在研究生物對毒物的蓄積與降減動態時，常用MAC作為生物對毒物敏感程度差異的指示參數[29]。一般認為，MAC為正值時，蓄積作用強于降減作用，MAC為負值時，降減作用強于蓄積作用；MAC值越大，即毒效蓄積幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大。王志錚等[30]研究三唑磷對彩虹明櫻蛤(Moerellairdescens)的急性毒性發現，各實驗時段的MAC值均大于零，表明蓄積過程在本次實驗中一直占據主導地位， 48～72 hMAC值最高，也是彩虹明櫻蛤死亡高峰出現時段；王志錚等[31]研究魚安對麥瑞加拉鯪魚(Cirrhinamrigola)幼魚的急性毒性發現，魚安MAC值在2～4 h時段最小為-51.436%,表現為較為顯著的毒物降減情形,在4～6 h時段達到最大，表現為較為顯著的毒物蓄積情形，6～8 h時段蓄積幅度趨于緩和，說明實驗4 h內為魚安在魚體內逐漸降減時段，之后魚體對魚安的蓄積趨于強勢，其中4～6 h時段為死亡高峰段。本實驗通過比較三苯基錫48、72 、96 h的MAC值，發現MAC的值呈明顯下降趨勢。在實驗48～72 h胭脂魚幼魚對三苯基錫的MAC值下降明顯，三苯基錫實驗48～72 h的MAC值是24～48 h的43.83%；在實驗72～96 h胭脂魚幼魚對三苯基錫的MAC值下降明顯，三苯基錫實驗72～96 h的MAC值是48～72 h的34.09%，說明其降解毒效能力增強，毒效蓄積速度下降，表明胭脂魚幼魚對三苯基錫敏感性較強，其降解毒效能力較弱。因此在探討污染物對生物的毒性效應時，應分析污染物毒性蓄積變化，充分考慮時效性才能更全面評估污染物的毒性效應。

3.3 微塑料對三苯基錫毒性效應的調節作用

本實驗研究了三苯基錫與聚苯乙烯微球單獨聯合的毒性效應。結果表明，高濃度聚苯乙烯微球與三苯基錫聯合暴露，可有效延緩三苯基錫的致死時間，暴露于三苯基錫高濃度組(0.126 mg/L)的胭脂魚幼魚，單獨或與聚苯乙烯結合，2 h后觀察到異常游泳，在其他低濃度處理組中都沒有觀察到此效應。已有研究表明，微塑料可經消化系統被水生生物吸收，而微塑料對魚體中的有機污染物具有較強吸附聚集作用，這可能是聚苯乙烯微球有效延緩三苯基錫致死時間的原因之一。乙酰膽堿酯酶(AchE)是生物神經傳導中的一種關鍵性酶，在膽堿能突觸間，該酶能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞。Oliveira等[32]研究表明，微塑料對鰕虎魚幼魚AchE分泌具有明顯抑制作用，與本實驗三苯基錫低濃度處理組與聚苯乙烯微球單獨或聯合暴露中，未觀察到胭脂魚幼魚異常游泳的結果一致。而聚苯乙烯微球延緩效果隨三苯基錫濃度升高而降低，高濃度組2 h后仍可觀察到異常游泳等實驗結果表明，微塑料對三苯基錫毒性效應的調節作用存在濃度閾值，而具體影響機制有待進一步研究。