飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道菌群的影響

譚鳳霞，柴 毅，彭 夢，楊代勤

(長江大學動物科學學院，湖北省黃鱔工程技術研究中心，湖北 荊州 434025)

黃鱔(Monopterusalbus)是廣泛分布于我國南北水域的一種名優養殖品種，隨著養殖密度的加大造成水體環境的惡化等因素引起的各種病害嚴重制約其規模化養殖。魚類消化道是病原入侵機體的門戶之一，而腸道內覆蓋在腸黏膜上的正常菌群是腸道防御外源致病菌入侵的天然屏障[1]。腸道中微生物的種類、數量等會隨著魚類的生長階段、生理狀態、生活環境及餌料組成等變化而處于動態變化之中[2-4]。一般情況下，魚類腸道內條件致病菌數量最多，益生菌次之，致病菌最少，細菌的種類及數量在一定程度上影響魚類腸道健康甚至機體健康。當外界條件(水質、餌料等)改變時，可能引起魚類不同程度的應激反應，腸道內的條件致病菌異常生長，由共棲菌轉為致病菌，導致菌群失調甚至爆發疾病，毒害魚體健康[5,6]。

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一類在生物體內廣泛存在，具有抗菌作用的小分子多肽的總稱，包括天蠶素(cecropins)、防御素(defensins)、蛙皮素(magainins)、蜂毒素(melitins)和細菌素(bacteriocin)等不同類型。抗菌肽作為機體天然免疫防御系統的重要組成部分，對細菌、真菌、病毒、寄生蟲、腫瘤細胞等均具有抑制作用，同時對生物體的自身細胞無破壞性，無免疫原性，是生物體用來抵制病原微生物入侵的重要屏障[7,8]。體內和體外抑菌試驗均表明，抗菌肽對常見的多種病原菌均具有抑制作用，能顯著降低病原菌的數量，維持養殖水環境和腸道的微生態平衡[9]。

目前已用于魚類飼料添加劑的抗菌肽包括天蠶素抗菌肽、Surfactin抗菌肽以及水產動物重組抗菌肽等。凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)[10]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[11]、鯉(Cyprinuscarpio)[12]、羅非魚(Oreochromis)[13-16]、花鱸(Lateolabraxmaculatus)[17]、黑鯛(Sparusmacrocephlus)[18]、石斑魚(Epinephelus)[19,20]等水產動物攝食抗菌肽可提高其生長性能、抗氧化能力和免疫能力。本實驗在黃鱔餌料中添加不同水平的抗菌肽(基因工程產品)，通過研究其對黃鱔腸道好氧和兼性厭氧細菌種類、數量的影響，為黃鱔養殖和病害防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與飼養管理

試驗用黃鱔，來自長江大學黃鱔養殖基地。暫養兩周后，將體格健壯，均重為(30±5)g的黃鱔隨機分為5組(對照組、組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ、組Ⅳ)，每組3個重復，每個重復60尾。從2018年7月20日—9月28日每天18 ∶00投喂一次，對照組投喂基礎餌料，試驗組分別投喂基礎餌料+200 mg/kg抗菌肽、基礎餌料+400 mg/kg抗菌肽、基礎餌料+600 mg/kg抗菌肽、基礎餌料+800 mg/kg抗菌肽，日投餌量占黃鱔體重7%～11%。基礎餌料為70%冰蚯蚓+30%黃鱔顆粒飼料，抗菌肽為深圳市圣西馬生物技術有限公司提供，商品名：太輕松W。

1.2 樣品采集及計數

試驗結束禁食后每組取3尾黃鱔，先用蒸餾水沖洗魚體表面，拭干，再用酒精棉球擦拭魚體表面消毒。在超凈工作臺內用滅菌解剖工具打開試驗魚腹腔取出腸道，用磷酸鹽緩沖液PBS pH=7.2沖洗腸道去除腸道內容物。將每組所取的3尾黃鱔的腸道混合，冰浴中勻漿，稱量混合勻漿液0.5 g，加入4.5 mL滅菌生理鹽水，制成腸道原液，然后進行梯度稀釋至10-7。取10-5、10-6、10-7三個梯度的稀釋液各100 μL，涂布于營養瓊脂平板，每個梯度做3個平行，然后將涂布好的平板置于28 ℃恒溫生化培養箱培養24 h。選取細菌生長疏密適當，菌落清晰，分散良好并且菌落數在30～300個的平板計數。將菌懸液濃度CFU/mL換算成每克腸道所含細菌的數量CFU/g，用IBM SPSS Statistics進行單因素方差分析。

1.3 腸道細菌鑒定

觀察記錄平板上的菌落特征，隨機挑取50個左右單菌落作為待測菌株，純化后接種在營養斜面上，28 ℃培養24 h后，置于4 ℃備用。針對腸道好氧和兼性厭氧細菌參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[21]按照以下步驟進行鑒定：①待測菌株進行革蘭氏染色，結合鏡檢將細菌分成革蘭氏陽性球菌、陽性桿菌、陰性球菌及陰性桿菌；②用玻璃棒蘸取菌苔與玻片上3% H2O2反應，立即產生氣泡者為陽性，反之為陰性；③用1%四甲基對苯二胺試劑濕潤的濾紙蘸取菌苔，觀察顏色變化，10 s內出現紅色者陽性，反之為陰性；④穿刺接種半固體營養瓊脂進行細菌動力試驗，培養后細菌在穿刺線周圍有擴散生長者為陽性，反之為陰性；⑤將待測菌同時接種兩支HL(Hugh-Leifson)葡萄糖培養基，一支滴加無菌液體石蠟，培養后兩支培養基均無變化者為產堿型(-)，兩支培養基均產酸者為發酵型(F)，僅不加石蠟的培養基產酸者為氧化型(O)。

1.4 多樣性分析

根據菌株鑒定結果，以各類細菌所占比例及其多樣性指數評價不同抗菌肽添加水平對腸道菌群結構的影響。

計算公式：

各類細菌在菌群中所占比例：Pi=Ni/N；

Shannon-Wiener指數：H′=-∑PilnPi

Simpson指數：D=1-∑(Pi)2

式中，Pi為第i類細菌在菌群中所占比例，Ni為第i類細菌的個體數目，N是腸道中全部細菌種類的總個體數。

2 結果

2.1 抗菌肽對腸道細菌總數的影響

采用平板菌落計數法對各組黃鱔腸道好氧和兼性厭氧菌進行計數，結果見表1。對照組細菌總數最多為(3.80±1.95)×107CFU/g，組Ⅲ細菌總數最少為(3.00±1.66)×107CFU/g，單因素方差分析表明各組腸道細菌總數無顯著性差異。

表1 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道細菌總數的影響Tab.1 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the total number of intestinal microflora of M.albus 107 CFU/g

2.2 腸道菌群鑒定

對黃鱔各組隨機分離純化50個左右菌落進行鑒定，如圖1所示，各組黃鱔腸道中鑒定出好氧和兼性厭氧菌共14類。通過革蘭氏染色結合鏡檢，將分離純化菌株分成陽性球菌、陽性桿菌、陰性球菌和陰性桿菌。對革蘭氏陽性球菌進行動力試驗，陽性者為動性球菌屬(Planococcus)。陽性球菌無動力細菌進行接觸酶試驗，陰性者為鏈球菌屬(Streptococcus)；接觸酶陽性者進行氧化發酵試驗，發酵型為葡萄球菌屬(Staphylococcus)，其他為微球菌屬(Micrococcus)。革蘭氏染色陽性桿菌進行動力試驗，無動力者為棒桿菌屬(Corynebacterium)。陽性桿菌中有動力細菌進行氧化酶試驗，陽性者為芽孢桿菌屬(Bacillus)，陰性者為乳桿菌屬(Lactobacillus)。革蘭氏染色為陰性球菌者為奈瑟菌屬(Neisseria)。而革蘭氏染色陰性桿菌是待測菌株中最多的類型。發酵型陰性桿菌進行氧化酶試驗，陽性者為氣單胞菌屬(Aeromonas)，陰性者為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)。其他陰性桿菌進行動力試驗，有運動性且為氧化型者為假單胞菌屬(Pseudomonas)，有運動性為產堿型者為產堿菌屬(Alcaligenes)；無運動性且氧化酶陽性者為黃桿菌屬(Flavobacterium)，陰性者為不動桿菌屬(Acinetobacter)。

圖1 腸道好氧及兼性厭氧菌鑒定結果Fig.1 Identification of isolated aerobic and facultative anaerobic strains from the intestinal

2.3 抗菌肽對腸道菌群組成的影響

各組分離純化的細菌的類型及各類細菌所占的比例如圖2。從圖中可見，對照組黃鱔腸道中以腸桿菌科(未分屬)、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬4類革蘭氏陰性菌為主，其含量分別為23.2%、14.3%、12.5%、14.3%，共占所有細菌的64.3%。與對照組相比，飼料中添加不同含量的抗菌肽均能降低腸道中腸桿菌科和黃桿菌屬細菌所占比例。腸桿菌科細菌在組Ⅰ～組Ⅳ中所占比例分別為18.5%、20.8%、17.6%、22.0%，黃桿菌屬細菌的所占比例分別為9.3%、9.4%、2.0%、4.0%。而氣單胞菌屬細菌在組Ⅰ和組Ⅳ中所占比例高于對照組，在組Ⅱ中所占比例最低為11.3%；假單胞菌僅在組Ⅲ中的所占比例低于對照組，為11.8%。腸道中除革蘭氏陰性桿菌外，革蘭氏陽性芽孢桿菌也在各組中所占比例較高，在對照組和各處理組中均為10%左右；而另一種革蘭氏陽性桿菌乳酸桿菌的含量在抗菌肽添加組的含量均比對照組高，在組Ⅲ中最高為13.7%。除桿菌之外，各組還分離鑒定出部分球菌，各類球菌在腸道中所占比例在10.7%～16.7%之間，在組Ⅰ中含量最高，在對照組中最低。

圖2 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道菌群組成的影響Fig.2 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the proportion of intestinal microflora of M.albus

黃鱔腸道中的優勢菌群中革蘭氏陰性桿菌腸桿菌科、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬細菌是魚類的主要條件致病菌，而革蘭氏陽性桿菌芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬細菌則是腸道中的主要益生菌。對其腸道中主要條件病原菌(腸桿菌科、黃桿菌屬、假單胞菌屬、氣單胞菌屬4類細菌所占比例總和)和益生菌(芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬2類細菌所占比例總和)進行分類比較，如圖3所示：隨著抗菌肽添加濃度的升高，腸道中條件病原菌的含量呈現先降后升的趨勢，而益生菌則呈現先升后降的趨勢。其中組Ⅲ(600 mg/kg)條件病原菌所占最低，比對照組64.3%下降10.2%；而益生菌所占比例最高，比對照組高出11.0%。隨著抗菌肽的添加量達到800 mg/kg時，黃鱔腸道中的條件病原菌的比例表現出上升的趨勢，其所占比例達到58.0%，高于組Ⅲ和組Ⅱ(400 mg/kg)中的比例；同時其益生菌的比例出現下降的趨勢，由組Ⅲ中23.5%的比例下降到16.0%。

圖3 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道優勢菌群組成的影響Fig.3 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the proportion of dominant intestinal microflora of M.albus

2.4 抗菌肽對腸道菌群多樣性的影響

抗菌肽不同添加水平處理組的腸道菌群多樣性顯示(圖4)：隨著抗菌肽添加量的增加，Shammon-Wiener多樣性指數(H′)和Simpson多樣性指數(D)均呈現出先升后降的趨勢。組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ的細菌多樣性指數均顯著高于對照組和組Ⅳ。其中組Ⅲ的多樣性指數最高，分別為H′ 2.35、D0.89。對照組腸道菌群多樣性指數最低，分別為H′ 2.25、D0.87。

圖4 飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道菌群多樣性的影響Fig.4 Effects of dietary antimicrobial peptide supplementation on the diversity of intestinal microflora of M.albus

3 討論

動物腸道菌群是按一定的比例組合，菌群間互相制約，互相依存，構建的一個復雜的微生物生態系統[1]。抗菌肽具有廣譜抗菌性，體內外試驗表明其對常見的多種病原菌具有抑制作用[22]。如飼料中添加基因工程抗菌肽Pc-pchc能降低黑鯛腸道內梭菌綱的相對豐度[18]，天蠶素抗菌肽能降低斜帶石斑魚腸道內條件致病菌弧菌的數量[19]，在一定程度上抑制腸道有害菌。翟少偉等[15]研究表明飼料中添加不同含量Surfactin抗菌肽對吉富羅非魚腸道可培養細菌總數無顯著性影響；蘇保元[19]研究表明飼料中添加天蠶素抗菌肽對斜帶石斑魚腸道細菌總數無顯著影響；本研究同樣發現飼料中添加抗菌肽對黃鱔腸道細菌總數無顯著性影響。相較于對腸道細菌總數的影響，抗菌肽作為飼料添加劑進入腸道可塑造和控制腸道菌群的組成，在降低腸道病原菌的同時增加益生菌的數量。如Surfactin抗菌肽能降低吉富羅非魚腸道致病性大腸桿菌[15]、斜帶石斑魚腸道中條件致病菌弧菌的數量[19]，同時增加乳酸菌的數量。本研究結果表明飼料中添加600 mg/kg基因工程抗菌肽，黃鱔腸道中腸桿菌科、黃桿菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬4類條件致病菌合占比例最低為45.1%，比對照組下降10.2%；而腸道益生菌乳桿菌屬所占比例由對照組的1.8%達到13.7%，且各抗菌肽添加組乳桿菌屬占比均比對照組高。腸道中致病菌和益生菌數量的變化表現為：致病菌數量的降低增加了腸道正常菌群和益生菌的營養物質和生存繁殖空間，從而改善腸道微環境。

腸道菌群多樣性的差異與飼料成分密切相關。郝耀彤等[23]對草魚飼喂蘇丹草，微生物多樣性指數顯示后腸樣品Shannon指數H′一般不低于4.25，而前、中腸樣品H′均未超過 4.25；而飼喂人工飼養草魚后腸多樣性指數不低于4.95。本研究中隨著抗菌肽添加量的增加，黃鱔腸道菌群Shammon-Wiener多樣性指數和Simpson多樣性指數均呈現出先升后降的趨勢。組Ⅰ、組Ⅱ、組Ⅲ的多樣性指數均顯著高于對照組和組Ⅳ。可見，在飼料中適量添加抗菌肽能提高腸道菌群的多樣性水平，改善腸道的微環境。 本研究同樣發現，在抗菌肽添加劑量達到800 mg/kg時，腸桿菌科、黃桿菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬等條件致病菌所占比例達到58.0%，超過了組Ⅱ(400 mg/kg，56.6%)和組Ⅲ(600 mg/kg，45.1%)中這4類細菌所占的比例；而乳桿菌屬所占比例為6.0%，雖然高于對照組1.8%和組Ⅰ(200 mg/kg)的3.7%，但是低于組Ⅱ的7.5%和組Ⅲ的13.7%。同時抗菌肽添加劑量達到800 mg/kg時，多樣性指數H′從2.35下降到2.28，D從0.89下降到0.87。可見，飼料中添加抗菌肽對腸道有益菌和致病菌的數量及菌群多樣性水平的調控與抗菌肽的劑量有關。抗菌肽的種類和飼喂魚類都影響抗菌肽在飼料中的添加量，如Surfactin抗菌肽在吉富羅非魚中的添加量超過50 mg/kg[15]，在花鰻鱺中超過25 mg /kg[24]，在斜帶石斑魚中超過100 mg/kg[25]；家蠅抗菌肽在黃顙魚中超過0.2%[26]，重組中國明對蝦抗菌肽在羅非魚中超過50 mg/kg[27]，天蠶素抗菌肽在建鯉中超過600 mg/kg時[28]，對魚類的生長有一定的抑制作用。

綜上所述，黃鱔基礎飼料中添加適量的抗菌肽具有調節黃鱔腸道菌群結構的效果。本試驗的基礎飼料中添加600 mg/kg抗菌肽投喂黃鱔后，較200 mg/kg和400 mg/kg劑量添加組其腸道中條件致病菌的組成比例最低，有益菌的組成比例最高，其菌群多樣性水平也最高。但抗菌肽添加劑量達到800 mg/kg時，其相關指標如條件致病菌的組成比例有所增加，有益菌的組成比例下降，菌群多樣性水平下降。因此，本試驗條件下，基礎飼料(70%冰蚯蚓+30%黃鱔顆粒飼料)中添加600 mg/kg抗菌肽飼喂黃鱔后，對其腸道菌群結構有較好的改善作用。